Возможности применения метода ГХ-МС (обзор)

(Газовая хроматография—масс-спектрометрия) (ГХ-МС) — метод количественного и качественного анализа широкого круга соединений, открывающий большие перспективы во многих областях, таких как токсикология, медицина, промышленность. ГХ-МС — комбинация двух мощных аналитических инструментов: газовой хроматографии, обеспечивающей высокоэффективное разделение компонентов сложных смесей в газовой фазе, и масс-спектрометрии, позволяющей идентифицировать как известные, так и неизвестные компоненты смеси.

Варианты использования газового хроматографа в качестве системы разделения и ввода пробы в масс-спектрометр были предложены еще в конце 50-х годов XX века [1, 2]. Исторически известны несколько типов интерфейсов ГХ-МС, однако в результате развития высокопроизводительной вакуумной техники и практически полного вытеснения ГХ с насадочными колонками (с большими потоками газа-носителя) подавляющее большинство производителей в настоящее время применяет так называемый прямой ввод пробы, т. е. непосредственный вывод конца колонки в область ионизации масс-спектрометра [2]. Применяемый в качестве газа-носителя гелий является легким газом, и избыток его легко удаляется вакуумной системой прибора.

ГХ-МС высокоспецифично характеризует вещества по газохроматографическим индексам удерживания и масс-спектрам. Вещества с перекрывающимися хроматографическими пиками различают по их масс-спектрам. С другой стороны, изомеры с похожими или идентичными масс-спектрами различают по индексам удерживания. Таким образом, ГХ и МС дополняют друг друга при анализе смесей.

Сфера применения метода ГХ-МС определяет- ся списком аналитов, которые могут быть разделены методом газовой хроматографии. Это относительно низкомолекулярные и термически стойкие аналиты, несущественно распадающиеся при нагреве в инжекторе хроматографа и имеющие среднюю или низкую полярность. Для анализа соединений другого типа необходим альтернативный метод анализа, например ВЭЖХ-МС.

Наиболее распространенным вариантом ГХ-МС был и остается анализ с применением ионизации электронным ударом (ЭУ) [1]. При проведении скрининга спектры, полученные при нормированных условиях ионизации (70 эВ), сравниваются с библиотечными масс-спектрами.

Для повышения селективности применяют альтернативные методы ионизации, чаще всего — химическую ионизацию с детектированием положительных (ПХИ) или отрицательных ионов (ОХИ) [1]. К сожалению, стандартизация спектров ХИ затруднена и является в основном специфичной для каждого прибора. Тем не менее воспроизводимость спектров на конкретном приборе, как правило, удовлетворительна и позволяет успешно проводить качественный (по молекулярному иону) и количественный анализ конкретных компонентов. ХИ редко применяется как скрининговый метод, чаще всего она используется для целевого определения аналитов или их групп.

Зачастую для анализа методом газовой хроматографии соединений, имеющих полярные группы ОН и NH, необходима стадия дериватизации. Обычно метаболиты большинства лекарственных и наркотических веществ имеют одну или несколько полярных групп разной природы; это могут быть первичные и вторичные аминогруппы H2NR и HNRR, имеющие основные свойства разной силы, фенольные или спиртовые гидроксигруппы, а также карбокси- и амидные группы, имеющие кислотные свойства разной силы. Наиболее часто для анализа метаболитов применяется ацетилирование уксусным ангидридом в присутствии основного катализатора типа пиридина или триэтиламина [3]. При ацетилировании происходит этерификация первичных и вторичных аминов, фенольных и спиртовых гидроксигрупп. Ацетилирование имеет ряд безусловных преимуществ: дешевизна реактивов, получение стабильных дериватов, отсутствие эффекта "привыкания" колонки. Однако из одного соединения с несколькими – ОН-группами может образоваться несколько дериватов с непостоянным количеством продуктов реакции, в силу того что существует возможность побочных реакций отщепления воды у некоторых соединений под действием сильного водоотнимающего средства — уксусного ангидрида [3].

Алкилирование (метилирование, этилирование или пропилирование) обычно применяется для идентификации и количественного анализа веществ, имеющих NH- и ОН-группы кислотного характера или карбоксильные группы [4, 5]. Триметилсилильные (ТМС) эфиры легко гидролизуются и нестабильны при хранении; кроме того, введение реагентов для получения ТМС-эфиров в колонку газового хроматографа при анализе ведет к ее "привыканию" [3]. Полифторированные реагенты (трифторуксусный, пентафторпропионовый и гептафтормасляный ангидриды) довольно дороги и также относительно легко гидролизуются, что ограничивает их применение; кроме того, для производных этих реагентов в библиотеках масс-спектров имеется очень мало справочных данных. Следует также отметить, что избыток реагентов после ацетилирования необходимо тщательно удалять, т. к. эти реагенты довольно реакционноспособны и могут повредить жидкую фазу колонки и металлические части масс-селективного детектора. Для целей скрининга часто используется ацетилирование смесью уксусного ангидрида с безводным пиридином, т. к. это один из самых простых и технологичных способов дериватиза-ции, который не требует особых мер предосторожности, и его преимущества для серийных массовых анализов намного превосходят его недостатки [3].

На сегодняшний день ГХ-МС находит свое применение в качестве аналитического метода при анализе нефти, нефтепродуктов, пищевых продуктов, загрязнений окружающей среды, в решении задач обеспечения безопасности, в медицине и токсикологии.

ГХ-МС В АНАЛИЗЕ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

В состав фракций нефти и нефтепродуктов могут входить тысячи компонентов. Простейшая фракция — природный газ, который состоит в ос- новном из метана. В зависимости от источника добычи природный газ может также содержать диоксид углерода, сероводород и легкие углеводороды (этан, пропан, бутан). Другие фракции с более высокими температурами кипения это — лигроин, средние дистилляты, масла и осадок. Эти фракции могут быть в дальнейшем очищены для получения бензина, дизельного и авиационного топлива, смазочных масел, асфальта. Некоторые из этих фракций переводят в основные растворители, олефины и ароматические соединения.

ГХ-МС используют для анализа фракций от природного газа до газойлей с температурами кипения до 650 °C. В связи с чрезвычайной сложностью молекулярного распределения в средних дистиллятах и газойлях жидкостно-хроматографическое разделение по полярности молекул облегчает последующий ГХ-МС-анализ. Нелетучие фракции можно анализировать с использованием пиролиза образца при температурах больше 450 °C, обычно 600–800 °C, перед ГХ-МС-анализом.

ГХ-МС интенсивно используется в органической геохимии нефти. Экстракты из геологических образцов (нефть, уголь, нефтематеринская порода, сланец) представляют собой сложные смеси органических соединений. Некоторые из них являются биомаркерами, которые могут дать информацию о происхождении нефти и угля и условиях отложения пород. Биомаркеры это углеводороды, сохранившие углеродный скелет находящихся на большой глубине древних организмов, претерпевших физико-химические превращения [6]. Биомаркерами являются изопреноиды, тритерпаны, стераны, порфирины.

Угли и сланцы содержат нерастворимые и нелетучие макромолекулярные компоненты — кероген. Это основной предшественник нефти и газа [7]. Для его анализа предложена техника мгновенного пиролиза в сочетании с ГХ-МС [8].

ГХ-МС используется при рутинных анализах бензина и других топлив с целью определить компонентный состав — парафины, изопарафины, олефины, нафталины и ароматику [9].

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ГХ-МС ДЛЯ АНАЛИЗА ЗАГРЯЗНЕНИЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

В настоящее время наибольшее внимание в вопросах исследования загрязнения окружающей среды уделяется анализу природных и сточных вод. ГХ-МС с онлайн твердофазной экстракцией позволяет достоверно определить следовые количества известных соединений и ориентировочно идентифицировать неизвестные соединения.

Табл. 1. Аналитические параметры некоторых пестицидов в водных образцах

Аналит	MW, Да	Линейный диапазон, нг/л	Предел обнаружения, нг/л
Дезэтилатразин	187	2–200	0.5
Атразин	215	1–200	0.2
Метолахлор	283	1–200	0.04
Трифлуралин	335	0.1–200	0.01
Карбофуран	221	0.1–200	0.1
Паратион-метил	263	2–200	1
Алахлор	269	0.1–200	0.05
Фенитротион	277	0.1–200	0.1
Фентион	278	0.1–200	0.1
Паратион-этил	291	5–200	2
Карбарил	201	1–200	0.1

Системы (ГХ—ионная ловушка) обеспечивают высокую чувствительность и повышенную селективность в режиме МС-МС. Так, ГХ-ИЛ в сочетании с онлайн твердофазной экстракцией была оптимизирована для определения следовых количеств полярных и неполярных пестицидов [10]. Превосходные тандемные масс-спектры были получены при концентрациях веществ в воде 0.1 нг/л (табл. 1) [9].

Система (ГХ—ионная ловушка—МС-МС) с предварительной твердофазной экстракцией (ТФЭ) была оптимизирована для алахлора и мето-лахлора с пределами обнаружения 0.1 мкг/л для обоих соединений [11].

Экспериментальное определение диоксинов, полихлорбифенилов (ПХБ), полихлортерфенилов (ПХТ) и токсафена стало важной задачей с тех пор, как было выявлено, что некоторые конгенеры диоксинов и ПХБ токсичны для животных, обладают высокой персистентностью и способностью накапливаться в природе [12].

Большое количество попыток было предпринято с целью определить токсичность каждого из конгенеров диоксинов и ПХБ и разработать масс-спектрометрические методики идентификации каждого конгенера на выходе из ГХ-колонки. Было предложено использование в качестве детектора квадрупольного тандемного масс-спектрометра, снабженного ионной ловушкой в качестве детектора, обладающего большой чувствительностью и специфичностью к диоксинам и ПХБ [13].

Фураны структурно близки к диоксинам, они совместно выделяются из природных образцов, что затрудняет анализ диоксинов, т. к. фураны одновременно с ними элюируются при хроматографическом разделении. Масс-спектрометр с квадрупольной ионной ловушкой позволяет иденти- фицировать полихлордибензо-п-диоксины среди десятков конгенеров и полихлордибензофуранов [13–15].

Одновременное элюирование конгенеров ПХБ в сложных смесях затрудняет их количественный анализ. Для решения этой проблемы была разработана ГХ-МС-система с химической ионизацией в масс-спектрометре [16, 17], позволяющая совместно определять одновременно элюирующиеся ди- о -замещенный конгенер 110 (2,3,3′,4′,6-пента-хлорбифенил) и о -незамещенный конгенер 77 (3,3′,4,4′-тетрахлорбифенил), при том что концентрация высокотоксичного конгенера 77 в природных образцах обычно в 100 раз меньше, чем конгенера 110.

Анализ ПХТ затруднен из-за сложности смесей, высоких температур кипения полихлорированных конгенеров и одновременного элюирования малохлорированных конгенеров и некоторых ПХБ (разделение можно улучшить, используя капиллярные колонки длиннее 50 метров).

Для анализа ПХТ обычно используют ГХ высокого разрешения с электронзахватным детектором (HRGC—ECD) [18] с МС-детектором с ионизацией ЭУ [19] или ОХИ [20]. HRGC—ECD обеспечивает удовлетворительную чувствительность и селективность при анализе ПХТ, однако присутствие похожих соединений, например высокохлори-рованных ПХБ или других тяжелых галогенированных соединений (полихлорнафталины, хлорор-ганические пестициды), может влиять на достоверность полученных результатов. К тому же возможен только полуколичественный анализ ПХТ.

Токсафен считается самым широкоиспользо-ванным инсектицидом в мире. Он состоит из по-лихлорборнанов (76 %), полихлорборненов (18 %), полихлорборнадиенов (2 %), других хлорированных углеводородов (1 %) и нехлорированных углеводородов (3 %) [21].

ГХ высокого разрешения в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения обеспечивает надежный анализ ПХТ и токсафена в природных и биологических объектах с высокой селективностью, при этом присутствие других полихлорированных соединений не препятствует анализу [22].

ГХ высокого разрешения с масс-спектрометрическим детектированием и ионизацией электронным ударом можно использовать в качестве референсного метода анализа ПХТ и токсафена с низкими пределами обнаружения (5–9 пг) [23].

ГХ-МС АНАЛИЗ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

ГХ-МС используют для анализа пищевых ароматизаторов. Предложены различные методы удаления летучих компонентов, связанных с ароматизаторами, из еды: динамический парофазный анализ и газовая экстракция (purge and trap) при исследовании оливковых и других пищевых масел [24], экстракция растворителем [25], высоковакуумная перегонка и перегонка с водяным паром [26], сверхкритическая флюидная экстракция [27] и твердофазная микроэкстракция [28, 29].

Ароматические соединения вяленой пармской ветчины были проанализированы методом ГХ-МС с термодесорбцией после экстракции с применением динамического парофазного анализа [30]; было идентифицировано 122 летучих соединений, в том числе углеводороды, альдегиды, спирты и эфиры.

Сверхкритическая флюидная экстракция в качестве метода пробоподготовки в пищевом анализе стала необычно популярна в последнее время. Эффективность использования сверхкритических жидкостей в исследованиях винных ароматических соединений была продемонстрирована и при оффлайн ТФЭ, и при онлайн ТФЭ-ГХ [31].

Твердофазную микроэкстракцию применяли при ГХ-МС-анализе (режим селективных ионов) 2,4,6-трихлоранизола, соединения, вызывающего "пробковую болезнь" вина [21]. Для количественного анализа в качестве внутреннего стандарта использовали полностью дейтерированный три-хлоранизол. Предел обнаружения составил 5 нг/л.

Твердофазную микроэкстракцию (ТФМЭ) применяли при анализе летучих соединений из яблок [32]. Time-compressed ГХ была предложена для уменьшения времени разделения без потери аналитических характеристик. ТФМЭ обеспечивает широкий линейный диапазон от ppb до ppm.

Для количественного определения ароматизаторов чаще всего применяют дейтерированные стандарты. Так, использование дейтерированных метоксипиразинов позволило провести идентификацию и количественный анализ метоксипиразинов винограда в различных красных винах на уровне нг/л [33].

Монотерпены, сесквитерпены и их кислородсодержащие производные являются важными компонентами основных растительных масел. Определение терпенов как ароматизаторов представляется важной задачей в медицине, ветеринарии, пищевой и косметической промышленности. Идентификация терпенов достаточно сложна, поскольку они обычно встречаются в смесях родственных соединений. ГХ считается самым быстрым и удобным методом разделения терпенов в смесях, особенно при использовании капиллярных колонок. Тем не менее ГХ-МС-анализ терпенов не всегда обеспечивает достоверный результат, поскольку различные вещества (гомологи, позиционные изомеры, стереоизомеры) могут иметь одинаковые спектры либо пики могут перекрываться. В этом случае используют газохроматографические индексы удерживания [34]. Для этого, по наиболее распространенной методике, терпены анализируют при помощи системы ГХ-ПИД на двух колонках различной полярности [35–37] в режиме программирования температуры. Для большей точности идентификации был введен такой параметр, как коэффициент распределения K p аналита между двумя несмешивающимися жидкостями ( н -гексан и ацетонитрил) [38].

ПРИМЕНЕНИЕ ГХ-МС В РЕШЕНИИ ЗАДАЧ ОБЕСПЕЧЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ

Метод ГХ-МС широко используют для анализа большинства взрывчатых веществ до и после взрыва [39], поскольку другие методы (ЯМР, ИК-спектроскопия) не позволяют достоверно анализировать взрывчатые соединения после взрыва, когда имеется очень сложная смесь со следовыми количествами взрывчатого вещества. Проблемы возникают лишь в случае нелетучих соединений, например нитроцеллюлозы, которая не элюируется с ГХ-колонки, и термически лабильных соединений, таких как тетрил и некоторые нитроэфиры, которые могут разлагаться или гидролизоваться в ГХ-инжекторе.

Лучше всего методом ГХ-МС анализируются нитроароматические соединения, которые довольно стабильны в условиях ГХ: тринитротолуол [40– 42], динитротолуолы, динитробензолы, нитротолуолы [43]. Нитропроизводные бензола, толуола, фенола и анилина, экстрагированные из водных растворов, были проанализированы методом ГХ-МС с различными типами ионизации: ЭУ, ПХИ, ОХИ. Наибольшая селективность (предел обнару- жения 1–3 пг) была достигнута при использовании ОХИ (метаном и аргоном) [44].

В рамках международной Конвенции о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении актуальна задача создания надежных методов анализа, позволяющих выявлять факты и контролировать степень интоксикации организма после воздействия токсичных химикатов.

Методы идентификации токсичных химикатов в биосредах по продуктам разложения их аддуктов получили значительное распространение в связи с тем, что для анализа продуктов разложения, являющихся низкомолекулярными соединениями, могут быть использованы газовая хроматография (ГХ) и газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС), ставшие в настоящее время общепринятыми и доступными средствами аналитической химии.

В ретроспективных исследованиях биосред жертв отравления зарином [45, 46] была проведена идентификация продуктов гидролиза зарина (изо-пропилметилфосфоновой и метилфосфоновой кислот) трипсином и щелочной фосфатазой посредством их ГХ-МС-анализа в виде соответствующих триметилсилиловых эфиров.

С помощью сочетания методов ГХ-МС и модифицированной методики секвенирования белков по Эдману была определена ковалентная модификация гемоглобина сернистым ипритом по N-концевому остатку валина [47]. Была продемонстрирована возможность установления факта воздействия иприта на организм человека путем им-мунохимического анализа N7-гуанинового аддукта в составе ДНК [46]. Разработаны методики определения иприта методом ГХ-МС с дериватиза-цией бис(гептафторбутиратом) и ионизацией ЭУ (предел обнаружения 5 нг/мл) [48] или бис(пентафторбензоатом) и ОХИ (предел обнаружения 1 нг/мл) [49]. Разработан подход к идентификации и оценке степени поражения люизитом путем анализа его аддуктов с гемоглобином [50].

При рутинных анализах VX методом ГХ-МС с ионизацией ЭУ определяют продукт его гидролиза — этилметилфосфоновую кислоту. Предел обнаружения в сыворотке крови человека составляет 1 нг/мл [51].

ГХ-МС-АНАЛИЗ В МЕДИЦИНЕ И ТОКСИКОЛОГИИ

В клинических анализах и определении нетоксичных веществ метод ГХ-МС не получил широкого распространения. Можно, однако, выделить некоторые области применения: клинический анализ стероидов и селективный скрининг врожденных ошибок метаболизма.

Способность ГХ-МС определять множество метаболитов стероидов одновременно в едином "стероидном профиле" остается до сих пор непревзойденной. Предложена методика определения 12 анаболических гормонов в моче с пределами обнаружения 0.5 нг/мл [52]. Показан метод определения 8 анаболических стероидов в тканях свиней после жидкостно-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) и дериватизации гептафторбутировым ангидридом с пределами обнаружения 0.9–1.5 мкг/кг [53].

Врожденные ошибки метаболизма представляют собой группу редких заболеваний. Для обнаружения излечимых врожденных заболеваний используют лабораторные скрининговые тесты. Такие биохимические исследования включают в себя анализ аминокислот в плазме и моче, органических кислот (интермедиатов в метаболизме аминокислот, жиров и углеводов), пуринов, пиримидинов, олиго- и полисахаридов в моче, карнитина, ацилкарнитина и длинных жирных кислот в плазме. Большую роль играет и определение органических ацидурий [54]. Именно их анализ является основным применением ГХ-МС в селективном скрининге [55, 56]. Органические кислоты экстрагируют из биологических жидкостей методом твердофазной экстракции, затем дериватизируют этерификацией обычно с N,O-бис(триметилсилил) трифторацетамидом, содержащем 1 % триметил-хлорсилана, реже диазометаном [57]. Кислородсодержащие кислоты предварительно переводят в оксимы с помощью гидроксиламина и его производных. Хроматографическое разделение проводят на капиллярных колонках.

Анализ анаболических стероидов, а также эстрогенов долгое время тесно связан с ГХ-МС. Сложность анализируемых образцов вынуждает использовать капиллярные колонки для разделения; в большинстве лабораторий применяют неполярные или малополярные колонки с силикагелем длиной 25–30 м. Для разделения изомеров иногда используют колонки длиной до 60 м. Для дополнительной очистки образца предложено использовать систему ГХ-ГХ с двумя колонками [58].

Развитие техники МС-МС позволило определять соединения в сложных смесях, поскольку во фрагментном спектре отсутствуют сигналы примесей [59].

Одна из основных областей применения ГХ-МС — токсикология и судебная медицина, поскольку это один из самых мощных, универсальных и чувствительных методов качественного и количественного определения наркотических и лекарственных веществ и их метаболитов в различных биологических образцах (кровь, плазма, моча, слюна, пот, волосы). К настоящему времени разработано множество методик определения большой группы наркотических и лекарственных веществ в плазме или цельной крови, использую- щих ГХ с азотно-фосфорным и масс-селективным детекторами [60], а также методик для скрининга отдельных групп лекарственных и наркотических веществ, бензодиазепинов [61–63], барбитуратов [64], амфетаминов [65], каннабиноидов [66], фенотиазинов [67], антиэпилептиков, антидепрессантов, нейролептиков и опиатов [68, 69] и т. д. В большинстве случаев образцы крови или плазмы анализируются для более точного количественного определения токсиканта, обнаруженного при скрининге мочи.

Подготовка образцов биожидкостей перед анализом должна включать в себя следующие стадии: разрушение конъюгатов (т. к. большинство полярных метаболитов наркотических и лекарственных веществ выводятся с мочой в конъюгированном виде); выделение анализируемых веществ из биоматериала; дериватизацию полярных труднолетучих аналитов и переочистку экстракта (если необходимо). В то же время важно, чтобы при подготовке образцов в анализируемых соединениях не нарушалась их основная структура, т. к. это приведет к трудностям их идентификации. Для разрушения конъюгатов обычно применяется либо мягкий, но продолжительный ферментативный гидролиз, либо более жесткий прямой кислотный гидролиз. Обычно ферментативный гидролиз используется в допинг-контроле и для анализа некоторых групп соединений, чувствительных к кислотному гидролизу (типа 1,4-бензодиазепинов, кокаина и др.). Для токсикологических анализов

Табл. 2. Значения m / z характерных фрагментных ионов для идентификации кислых и нейтральных лекарственных и наркотических препаратов в моче при использовании в одновременном скрининге.

Метод анализа — ГХ-МС; пробоподготовка: кислотный гидролиз, жидкость-жидкостная экстракция, дериватиза-ция (ацилирование)

Классы лекарств	Наблюдаемые ионы ( m / z )	Ссылки
Антидепрессанты, трициклические	58, 84, 86, 100, 191, 193, 194, 205 и 120, 182, 195, 235, 261, 276, 284, 293	[70, 71]
Антидепрессанты, SSRI	58, 72, 86, 173, 176, 234, 238, 290	[72]
Нейролептики, бутирофеноны	112, 123, 134, 148, 169, 257, 321 и 189, 191, 223, 233, 235, 245, 287, 297	[73]
Нейролептики, фенотиазины	58, 72, 86, 98, 100, 113, 114, 141 и 132, 148, 154, 191, 198, 199, 243, 267	[74]
Бензодиазепины	111, 205, 211, 230, 241, 245, 249, 257, 308, 312, 333, 340, 357	[75, 76]
Барбитураты	83, 117, 141, 157, 167, 207, 221, 235	[77]
Антиконвульсанты	102, 113, 146, 185, 193, 204, 208, 241	[78]
Лекарства против болезни Паркинсона	86, 98, 136, 150, 165, 196, 197, 208	[79]
Фенотиазиновые антигистамины	58, 72, 100, 114, 124, 128, 141, 199	[80]
Алканоламиновые антигистамины	58, 139, 165, 167, 179, 182, 218, 260	[81]
Этилендиаминовые антигистамины	58, 72, 85, 125, 165, 183, 198, 201	[82]
Алкиламиновые антигистамины	58, 169, 203, 205, 230, 233, 262, 337	[83]
Опиаты и опиоиды	111, 138, 187, 245, 259, 327, 341, 343, 359, 420	[84]
Неопиоидные анальгетики	120, 139, 151, 161, 188, 217, 230, 231, 258, 308	[85]
Стимулирующие вещест-ва/галлюциногены	58, 72, 86, 82, 94, 124, 140, 192, 250	[86–92]
Антиаритмические	72, 86, 98, 140, 151, 159, 200, 335	[88]
Лаксативы	349, 360, 361, 379, 390, 391, 402, 432	[93]

(особенно, срочных) обычно предпочитается кислотный гидролиз [5]. При этом обязательно необходимо учитывать возможность гидролиза соединений, имеющих сложноэфирные и амидные связи, а также иногда и простые эфирные связи. Для целей скрининга наркотических и лекарственных веществ может быть применен кислотный гидролиз в растворе 7 %-й соляной кислоты.

В качестве методов пробоподготовки используют ЖЖЭ, ТФЭ или ТФМЭ. При систематическом токсикологическом анализе для процедур поиска неизвестного яда обычно предпочитают ЖЖЭ как наиболее универсальный метод выделения. В то же время для подтверждения наличия определенного вида наркотического или лекарственного вещества предпочтение отдается ТФЭ или ТФМЭ. В случае, когда требуется одновременная экстракция нескольких веществ, как было показано [3] на примере фенобарбитала, атропина и морфина, можно подобрать условия (смесь хлоро-форм—изобутанол (6:1) при рН водной фазы от 7.2 до 9), при которых степень экстракции фенобарбитала и атропина максимальна, а морфина минимальна.

Зачастую соединения таких классов необходимо дериватизировать, чтобы улучшить их хроматографические параметры [3]; чаще всего используют силилирование.

Для скрининга лекарственных и наркотических веществ обычно используют капиллярные колонки с неполярной или слабополярной неподвижной жидкой фазой — 100 % диметилсилоксан, 5 % фе-нил-диметилсилоксан и другие им подобные [5]. Если для 100 %-го диметилсилоксана (фаза типа НР-1 или Ultra-1) существуют достаточно обширные хроматографические базы данных [94], то для других фаз сведения об индексах удерживания относительно редки и разрозненны, что затрудняет их использование для поиска и идентификации лекарственных веществ и их метаболитов. Однако индексы удерживания для 100 %-го диметилси-локсана и слабополярных фаз типа НР-5 (Ultra-2, PAS-5, Rtx-5, XTI-5, MXT-5, DB-5, SE-54, SPB-5, PTE-5, SAC-5, AT-5, BP-5, BPX-5, OV-5, PE-2) хорошо коррелируют между собой. Для расчета времен удерживания на слабополярных фазах соединений, для которых известны индексы удерживания на фазе типа НР-1, существуют специальные программы, позволяющие рассчитывать ориентировочные времена удерживания для интересующих веществ при конкретных газохроматографических условиях [3]. Наряду с перечисленными параметрами значимой информацией для идентификации соединений являются значения масс характеристичных ионов — это набор ионов, образующихся при фрагментации аналита в масс-спектрометре. Характеристические ионы используют при идентификации классов соединений.

В табл. 2 приведены значения m / z характеристичных фрагментных ионов для идентификации кислых и нейтральных лекарственных и наркотических препаратов в моче при одновременном скрининге. После определения классов соединений проводят более детальную идентификацию — поиск конкретных веществ. Примеры характеристических ионов некоторых лекарственных и наркотических препаратов в плазме крови человека приведены в табл. 3 [95].

На сегодняшний день разработано большое количество ГХ-МС-методик скрининга лекарственных и наркотических препаратов. В табл. 4 представлены некоторые из них.

Предложена методика для скрининговых тестов волос и мочи для одновременного определения более 100 наркотиков, в частности героина и его метаболитов [96]. Методика одновременного определения опиатов, кокаина и основных метаболитов в волосах человека в режиме МС электронного удара обеспечивает пределы обнаружения 0.1– 0.8 нг/мл. Показана методика количественного определения амфетаминов, кокаина и опиатов в волосах человека с использованием ТФЭ и дерива-тизации (смесью пропионовой кислоты и пиридина) с пределами обнаружения 0.05–0.30 нг/мл [97].

Амфетамины также продуктивно анализируются методом ГХ-МС. ТФМЭ использовали для парофазного анализа мочи и определили и амфетамин, и метамфетамин [98]. При применении пен-тадейтерированного метамфетамина в качестве внутреннего стандарта пределы обнаружения составили 0.1 мкг/мл для обоих соединений. Пределы обнаружения удалось понизить при деривати-зации обоих соединений пропилхлороформатом до 25 нг/мл [99]. При дериватизации гептафторбу-тилимидазолом и ионизации электронным ударом пределы обнаружения составили 0.01 мкг/г для обоих соединений [100], а при химической ионизации аммиаком — 90 нг/мл [101].

Для определения кокаина и его подтверждающего анализа были разработаны методики ГХ-МС [102–104] для аналитов из образцов волос [105]. Большое внимание уделяется постмортемным исследованиям. Постмортемные концентрации кокаина и кокаэтилена в крови и тканях крыс, которым вводили кокаин, кокаэтилен и этанол, измеряли посредством ГХ-МС [106]. Было установлено, что кокаэтилен более стабилен в постмортем-ных образцах, чем кокаин.

Поскольку марихуана является одним из самых распространенных наркотиков, множество исследований проводится по определению каннабиноидов и их метаболитов [107]. С использованием ионизации электронным ударом в режиме одиночных ионов даже без дериватизации возможно определять тетрагидроканнабинол, каннабидиол и каннабинол в волосах [108]. Пределы обнаружения

Табл. 3. Характеристические фрагментные ионы для идентификации некоторых лекарственных и наркотических препаратов в плазме крови человека

Соединение Характеристические ионы (m/z) Атрацин 215, 200, 173, 68, 58 Барбитал 156, 141, 112, 98, 83 Бромазепам 315, 286, 236, 208, 179 Бупивакаин 288, 245, 140, 98, 84 Бутабарбитал 183, 156, 141 Вепарамил 303, 260, 151, 58 Диазепам 284, 283, 256, 221, 77 Кетамин 237, 209, 180, 152, 102 Клозапин 326, 256, 243, 192, 70 Кодеин 299, 229, 162, 124 Кофеин 194, 109, 82, 67, 55 Лидокаин 234, 120, 86, 72, 58 Метадон 309, 294, 223, 165, 72 Метилфенилбарбитал 218, 132, 104, 78 Метилфенобарбитал 246, 218, 146, 117 Никотин 162, 133, 84 Нитрендипин 360, 331, 238, 210, 150 Нордазепам 270, 269, 242, 241, 77 Нордацепам 270, 269, 242, 241, 77 Преднизолон 300, 122, 91 Пропофол 178, 163, 121, 117, 91 Секобарбитал 209, 195, 168, 167, 141 Талбутал 167, 153, 124, 97 Темазепам 300, 271, 256, 228, 77 Тетразепам 288, 259, 253, 225 Фенитоин 252, 223, 180, 104, 77 Фенобарбитал 232, 204, 161, 146, 117 Фенотиазин 199, 167 Флуконазол 224, 155, 141, 127, 82 составили 0.01–0.1 нг/мг при использовании внутреннего стандарта. При дериватизации ангидридом пентафторпропионовой кислоты 11-nor-9-карбокситетрагидроканнабинол был проанализирован с химической ионизацией метаном в режиме регистрации отрицательных ионов с пределом обнаружения 5 пг/мг в волосах [109].

Количественное определение тетрагидроканнабинола в тканях человека с предварительным метилированием и использованием дейтерированных стандартов показано с пределами обнаружения 1 нг/г [110].

Определять барбитураты в моче возможно даже без предварительной подготовки образца с использованием калибровочных кривых и дейтерированных внутренних стандартов с пределами обнаружения 1 нг/мл [111].

Определение ЛСД в биологических образцах затруднено из-за малого количества вводимого наркотика для достижения галлюциногенного эффекта [112]. ГХ-МС обычно используют как подтверждающий метод после иммунологических исследований. Необходима дериватизация, чаще всего силилирование, образца. Предел обнаружения 10 пг/мл был достигнут при химической ионизации аммиаком и метаном для ЛСД из образцов мочи.

ГХ-МС в режиме full-scan электронного удара является референсным методом для подтверждения положительных тестов на допинг (проба B; проба А определяется иммунологическим анализом) в случае заранее оговоренного списка запрещенных препаратов [113]. В противном случае, когда требуется определить множество токсикантов (несколько тысяч только коммерческих) в биологической пробе чаще всего используют ГХ-МС, а не ВЭЖХ с диодной матрицей, поскольку последний метод менее специфичен [114, 115]. Например, была разработана процедура определения стимулирующих веществ, наркотиков и многих их метаболитов в моче. Образцы мочи подвергали ферментативному гидролизу, затем использовали твердофазную экстракцию с последующей дериватизацией N-метил-N-триметилсилил-трифторацетамидом. Посредством ГХ-МС-систе-мы удалось идентифицировать примерно 100 соединений и метаболитов [114].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, тандемная система (газовая хроматография—масс-спектрометрия), история которой насчитывает уже более полувека, является проверенным аналитическим методом и находит

Табл. 4. ГХ-МС-методы для скрининга лекарственных и наркотических препаратов

Число лекарств	Образец	Экстракция	Предел определения	Ссылка
80 основных	Внутренности	ЖЖЭ, бутилацетат	—	[116]
175 основ ных	Кровь или моча	ЖЖЭ, бутилхлорид	—	[117]
56 кислых и основных	Биологические жидкости	ЖЖЭ, дихлорметан	<1 мг/л	[118]
11 гипнотик-седативных	Сыворотка крови	ЖЖЭ, дихлорметан	0.5 мг/л	[119]
52 кислых и нейтральных	Кровь	ЖЖЭ	1–20 мг/л	[120]
60 кислых и нейтральных	Кровь	ЖЖЭ, этилацетат	10 мг/л	[121]
10 кислых	Кровь	ЖЖЭ, толуол/метилацетат 8:2	0.25–1 мг/л	[122]
102 основных	Кровь	ЖЖЭ, толуол	0.2 мг/л	[123]
110 основ ных	Кровь	ЖЖЭ, бутилхлорид	0.1 мг/л	[124]
200 нейтральных и основных	Кровь или ткани	ЖЖЭ, бутилхлорид	0.01–0.3 мг/л	[125]
26 кислых	Сыворотка крови	ЖЖЭ, диэтиловый эфир, силинирование (N-метил-N-(трет-бутилдиметилсилил)трифторацетамид)	—	[126, 127]
40 основных	Кровь	ЖЖЭ, дихлорметан/толуол 1:9, ацилирование (гептафторобутиловый ангидрид)	0.01–0.1 мг/л	[122]

свое применение во многих областях: анализе нефти, нефтепродуктов, пищевых продуктов, загрязнений окружающей среды, в решении задач обеспечения безопасности, в медицине и токсикологии. Данный метод позволяет селективно и с высокой чувствительностью определять различные типы соединений в пробах, как правило являющихся сложными смесями.