Возможности секвенирования нового поколения при исследовании мутационного статуса больных хроническим лимфолейкозом

Современные методы молекулярной диагностики лимфопролиферативных заболеваний построены как на уже считающихся классическими исследованиях генома — цитогенетическом анализе (стандартное кариотипирование, флюоресцентная in-situ гибридизация (FISH), методах полимеразной цепной реакции (ПЦР)), так и на стремительно развивающихся методах секвенирования. Новейшая технология расшифровки генома — секвенирование нового поколения (Next Generation Sequencing, NGS), ставшая одним из перспективных направлений среди диагностических методов.

Технология NGS обеспечивает анализ генетического профиля различных лимфопролиферативных заболеваний [1, 2, 3], включая ХЛЛ, с точностью до одного нуклеотида.

Технология NGSи ХЛЛ. Секвенирование нового поколения представляет собой усовершенствованный метод Сэнгера,основанный на электрофорезе и открытый более 40 лет назад [4]. Технологии NGS позволили преодолеть два основных недостатка метода Сэнгера: низкую пропускную способность и относительно высокую себестоимость. Принцип NGSоснован на возможности одновременного прочтения множества генов,в том числе всего генома, увеличивая при этом скорость исследования и объем полученных данных,при снижении себестоимости анализа.

Технология NGS стала генетическим тестом, позволяющим,в зависимости от поставленной задачи, как секвенировать весь геном или экзом, так и использовать таргетные панели генов.

Исследование, выполненное группой ученых Quesada V., et al. (2012) на образцах 105 пациентов с ХЛЛ, позволило выявить 1246

соматических мутаций, потенциально влияющих на функцию генов. При этом более чем в одном образце опухоли идентифицировали 78 функционально измененных генов. Ген SF3B1 был мутирован у 9,7 % больных, а дальнейший анализ полученных данных показал ассоциацию мутаций в гене SF3B1 с быстрым прогрессированием заболевания и сокращением общей выживаемости пациентов [5].

Puente X., et al. провели сочетанное полногеномное и полноэкзомное секвенирование образцов 4-х пациентов с ХЛЛ и выявили 46 соматических мутаций, потенциально изменяющих функцию генов. Дальнейший анализ данных мутаций у 363 пациентов с ХЛЛ выявил реккурентные мутации в 4 генах: NOTCH1, XPO1, MYD88 и KHLH6 [6]. Насколько известно, это первый комплексный анализ клинических данных и результатов полногеномного секвенирования. Было выявлено, что мутации MYD88 и KHLH6 преобладают в случаях ХЛЛ с мутированным статусом вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов, тогда как мутации NOTCH1 и XPO1 — с немутированным статусом.

Работы Landau D., et al., выполненные в 2013 г. [7] и в 2015 г. [8], позволили раскрыть паттерны клональной эволюции ХЛЛ и связать появление новых субклонов трансформированных В-лимфоцитов с неблагоприятными клиническими исходами.

Таким образом, полногеномное и полноэк-зомное секвенирование при ХЛЛ привело к открытию новых драйверных мутаций, включая мутации в некодирующих областях, и позволило пролить свет на роль сигнальных путей в патогенезе ХЛЛ.

В настоящее время, результаты выполненных NGSисследований у больных ХЛЛ свидетельствуют об участии в патогенезе ХЛЛ 8 основных сигнальных путей из известных 12 с выявленными драйверными мутациями в них [9].

Предполагаемые сигнальные пути ХЛЛ (рисунок 1) :

• 1.    сигнальный путь NOTCH: NOTCH1, FBXW7 [5, 6, 10].

• 2.    сигнальный путь Wnt: LRP1B [5, 6, 10], MED12 [7, 11], FAT1 [12, 13], NkD2 [14].

• 3.    путь передачи сигнала через В-клеточный рецептор: BTK и PLCG2 [12, 13], NRAS и KRAS [7, 15], BRAF [16, 17], ITPKB [7, 14, 18], KLHL6 [5, 6, 10].

• 4.    врожденный воспалительный ответ: MYD88 [5, 6, 10], RIPK1 [7, 19], BIRC3, MAP2K1 и MAP2K3 [14], MAPK1 [5, 6, 10].

• 5.    модификация хроматина: MYM3 [5, 6, 10], CHD2 [6, 7, 20], HIST1H1E [7, 21], HIST1H1C [14].

• 6.    процессинг и транспорт мРНК: SF3B1 и DDX3X [5, 6, 10], XPO1 [6, 7, 20]; RPS15, POLR3B и RANBP2 [14].

• 7.    дифференцировка В-клеток: BCOR [7, 22], EGR2 [7, 16, 23], IK F3 [14].

• 8.    ответ на повреждения ДНК, контроль клеточного цикла: TP53 и ATM [5, 6, 10], SAMHD1 [7, 24], POT1 [6, 7, 20], BRCC3 [14].

  

  Рисунок 1. Основные предполагаемые клеточные пути ХЛЛ (адаптировано из [25]).

  
  

Целью настоящего исследования является разработка таргетной NGS-панели для диагностики мутационного статуса больных ХЛЛ, основанная на опубликованных современных данных (таблица 1).

Таблица 1.

Таргетная NGS-панель для диагностики соматических мутаций ХЛЛ

№	Название гена	Локализация гена	Транскрипт*	Частота встречаемости
1	ATM	11q22.3	NM_000051.3	8–25,6 % [7, 8, 26, 27, 29]
2	BCOR	Xp11.4	NM_001123385.2	2–8,1 % [7, 8, 27]
3	BIRC3	11q22.2	NM_001165.5	4–15,5 % [8, 26, 27, 29]
4	BRAF	7q34	NM_001374244.1	2,5–5 % [8, 28, 29]
5	BRCC3	Xq28	NM_001018055.2	1 % [8]
6	BTK	Xq22.1	NM_000061.3	1–10 % [28]
7	CHD2	15q26.1	NM_001271.4	4–5 % [7, 8]
8	DDX3X	Xp11.4	NM_001356.5	2 % [7, 8]

Продолжение таблицы

№	Название гена	Локализация гена	Транскрипт*	Частота встречаемости
9	EGR2	10q21.3	NM_000399.5	1–3 % [7, 8]
10	FAT1	4q35.2	NM_005245.4	8,1 % [27]
11	FBXW7	4q31.3	NM_001349798.2	1,3–5 % [8, 26, 29]
12	H1–4 (HIST1H1E)	6p22.2	NM_005321.3	1–3 % [7, 8]
13	H1–2 (HIST1H1C)	6p22.2	NM_005319.4
14	IKZF3	17q12–21.1	NM_012481.5	2 % [8]
15	ITPKB	1q42.12	NM_002221.3	2 % [7]
16	KRAS	12p12.1	NM_033360.4	2–4,7 % [7, 8, 27]
17	LRP1B	2q22.1-q22.2	NM_018557.3
18	MAPK1	22q11.22	NM_002745.5	2 % [8]
19	MAP2K1	15q22.31	NM_002755.4
20	MAP2K3	17p11.2	NM_145109.3
21	MED12	Xq13.1	NM_005120.3	2 % [7, 8]
22	MYD88	3p22.2	NM_002468.5	1, 5–10 % [7, 8, 25, 27, 29]
23	NOTCH1	9q34.3	NM_017617.5	4–24,1 % [7, 8, 26, 27, 29]
24	NkD2	5p15.33	NM_033120.4
25	NRAS	1p13.2	NM_002524.5	1,5–10 % [7, 8, 26, 27]
26	PLCG2	16q23.3	NM_002661.5
27	POLR3B	12q23.3	NM_018082.6
28	POT1	7q31.33	NM_015450.3	2,5–7 % [7, 8, 27, 29]
29	RANBP2	2q13	NM_006267.5
30	RIPK1	6p25.2	NM_001354930.2	3 % [7]
31	RPS15	19p13.3	NM_001018.5	0,88–19,5 % [8, 26]
32	SAMHD1	20q11.23	NM_015474.4	2–9,8 % [7, 8, 26]
33	SF3B1	2q33.1	NM_012433.4	5–24,9 % [7, 8, 26–29]
34	TP53	17p13.1	NM_000546.5	5,3–50 % [7, 8, 26, 27, 29]
35	XPO1	2p15	NM_003400.4	1,8–11,5 % [7, 8, 26–28]
36	ZMYM3	Xq13.1	NM_201599.3	2–3 % [7, 8, 29]

Примечания : *Справочные номера транскриптов могут быть обновлены вследствие изменения версии базы данных RefSeq (NCBI Reference Sequence Database, Референсная база данных последовательностей Национального центра биотехнологической информации) [30].

Молекулярное разнообразие ХЛЛ определяет его выраженную клиническую гетерогенность: от наблюдаемых десятилетиями и не нуждающихся в терапии, до быстропрогрессирующих в течение нескольких месяцев,несмотря на активное лечение. Понимание молекулярных характеристик, лежащих в основе патогенеза ХЛЛ, становится приоритетом в свете расширяющихся возможностей современной таргетной терапии ХЛЛ (рисунок 2).

Одним из первых достижений в терапии ХЛЛ стали разработка и применение моноклональных антител: анти-CD20 (ритуксимаб, офатуму-маб, обинутузумаб) и анти-CD52 (алемтузумаб), эффективность которых доказана многочисленными клиническими исследованиями [31–38] и последующей рутинной практикой.

Внедрение таргетных препаратов в клиническую практику стало следующим важным достижением в терапии ХЛЛ. В проводимых исследованиях была доказана высокая эффективность и относительно низкий профиль токсичности ингибиторов В-клеточного сигнального пути (ибрутиниб [39, 40], акалабрутиниб [41, 42], иделалисиб [43]), ингибитора Bcl-2 (венетоклакс [44, 45]) и иммуномодуляторов (леналидомид [46, 47]).

Химиотерапия	Моноклональные антитела	BCR ингибиторы	BCL2 ингибиторы	CAR-T клеточная
	Анти-CD20: ✓ Ритуксимаб ✓ Обинтузумаб ✓ Офатумумаб Анти-CD52 Алемтузумаб	ВТК ингибиторы ✓ Ибрутиниб Акалабрутиниб PI3K ингибиторы Идеалисиб Дувелисиб	✓ Венетоклакс	терапия
Хлорамбуцил
Флударабин Циклофосфамид Бендамустин			Иммуномодуляторы Леналидомид	Аллогенная трансплантация костного мозга

Сопроводительная терапия

^ - зарегистрированные таргетпые препараты в РФ

Рисунок 2. Возможности терапии ХЛЛ в 2020 г.

Иммунохимиотерапевтические комбинации и новые лекарственные агенты улучшили качество и продолжительность ответов с ожидаемым временем наступления прогрессирования заболевания, превышающим пятилетний порог, тем самым увеличивая время наблюдения, необходимое для оценки клинически значимых различий беспрогрессивной выживаемости и общей выживаемости в проводимых исследованиях [48].

Заключение. Секвенирование нового поколения применяется в онкогематологии как в диагностических,так и в прогностических целях. Полногеномное и полноэкзомное NGS позволило раскрыть выраженную генетическую и эпигенетическую гетерогенность ХЛЛ. Накопленные к настоящему времени данные и их интерпретация еще не достаточны для выяснения прогностической значимости всех выявленных мутаций в генах ХЛЛ, что обосновывает необходимость проведения дополнительных исследований. Разработка панелей генов для анализа их мутационного статуса при ХЛЛ позволяет воссоздавать молекулярный профиль опухоли и выбирать на его основе оптимальные схемы лечения. Кроме того,накопление информации о предполагаемых клеточных путях, задействованных в патогенезе ХЛЛ, способствует опреде- лению драйверных мутаций в генах, которые могут являться потенциальными «мишенями» для разработки новых таргетных препаратов.

Революционные изменения в лечении ХЛЛ с использованием таргетных препаратов в течение последних пяти лет закономерно снизили частоту использования химиопрепаратов. Продолжающиеся в настоящее время разработки таргетных препаратов и их комбинаций направлены, прежде всего, на ограничение длительности терапии с сохранением ее высокой эффективности, при снижении токсичности и частоты возникновения резистентности. Пожалуй, задача на ближайшие годы исследований — молекулярное профилирование опухолевых клонов ХЛЛ и внедрение приемлемых программ таргетной терапии в реальную клиническую практику.

Технология высокопроизводительного секвенирования нового поколения,как часть масштабных трансляционных исследований, позволяет совершенствовать лечение лимфопролиферативных заболеваний, таких как ХЛЛ,в частности и онкогематологических заболеваний в целом, позволяя планировать разработку и применение персонифицированного подхода к терапии.