Возрастные особенности хемилюминесценции клеток крови перепелов

Кровь является жидкой тканью организма, обладающей сложными и разносторонними функциями. Она реагирует на экстремальные внешние и внутренние воздействия не только изменениями соотношения клеточных элементов, но и колебаниями интенсивности их метаболизма. Известно, что гранулоциты и моноциты крови обладают способностью генерировать активные радикалы кислорода, объемы которых резко увеличиваются при контакте с чужеродными веществами [1]. Индукторами функциональной активности фагоцитов крови могут быть крупнодисперсные частицы [2], микроорганизмы [3], циркулирующие иммунные комплексы [4]. В последние годы появляются публикации, освещающие некоторые аспекты продукции активных форм кислорода клетками цельной крови или фракционированными лейкоцитами разных видов диких и домашних птиц [5, 6]. Однако достоверные данные о кинетике течения свободнорадикальных процессов в фагоцитах крови перепелов, отличающихся высокой устойчивостью к инфекционным болезням, отсутствуют, что делает актуальным представленные научные исследования.

Целью работы являлось изучение возрастных особенностей генерации свободных радикалов кислорода клетками цельной крови перепелов хемилюминесцентным методом. В задачи исследования входило определение спонтанной (в состоянии покоя) и индуцированной (при фагоцитозе) люцигенин- и люминолусиленной хемилюминесценции (ХЛ) клеток крови перепелов 1–240-суточного возраста.

Объекты и методы

Исследования проведены на кафедре анатомии, патологической анатомии и хирургии ФГБОУ ВО «Красноярский ГАУ» и на базе Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН с сентября 2015 г. по январь 2016 г. Объектом исследований являлись японские перепела разного пола 1-, 14-, 30-, 60-, 90-суточного возраста из парка флоры и фауны «Роев ручей» (г. Красноярск) и перепела 240-суточного возраста, поступившие из фермерского хозяйства. Материалом для исследований служила венозная гепаринизированная кровь в разведении 1 : 1 неокрашенным раствором Хенкса. Всего исследовано 28 образцов крови. Хемилюминесцентный анализ проведен по методу В.М. Земскова с соавторами [7] в модификации Г.В. Макарской с соавторами [8]. Кинетика спонтанной и индуцированной (активированной) хемилюминесценции регистрировалась на 36-канальном хемилюминометре CL-3604 (Красноярск), совмещенном с ПЭВМ. Время записи хемилюминесцентной кривой – 90 мин, температура в регистрационной камере +42 ºС. Для усиления хемилюминесценции в качестве ХЛ-зондов использованы люци-генин и люминол, обладающие выраженной селективностью в отношении первичных (суперок-сиданион) и вторичных (гидроксил, гипохлорид, перекись водорода) радикалов кислорода. Антигенная активация фагоцитов крови осуществлена in vitro частицами латекса, опсонизированными белками сыворотки крови взрослых кур. Определены показатели кинетики ХЛ-реакции: амплитуда максимальной активности (Imax, имп./с); время достижения максимума (Tmax, мин); светосумма (S, имп. за 90 мин); индекс активации (ИА = Sакт/Sспонт, усл. ед.). На основании полученных данных рассчитана удельная антигениндуцированная продукция свободных радикалов лейкоцитами и фагоцитами крови (S/лейкоцит и S/фагоцит, имп./кл.).

После завершения регистрации ХЛ-реакции микроскопированием в камере Горяева установлено общее содержание лейкоцитов и их фагоцитарная активность. Для дифференциации клеток образцы крови окрашены 0,25 %-ным раствором генцианвиолетта, приготовленном на 3%-ном водном растворе уксусной кислоты. Статистическая обработка цифрового материала проведена методом вариационной статистики с помощью прикладных программ Microsoft OfficeExcel 2010. Возрастные различия параметров ХЛ считали достоверными при Р ≤ 0,05. Микроскопия и микрофотографирование проведены на микроскопе МС 100 (Micros, Austria) цифровой камерой CAM V200 (Vision, Austria).

Результаты исследований

Кинетика генерации всех видов активных форм кислорода (АФК) клетками крови перепелов демонстрировала значительные колебания в разные возрастные периоды. Минимальные показатели суммарной продукции люцигенинзависимых радикалов как при спонтанной, так и при антигениндуцированной латексом ХЛ-реакции зарегистрированы у перепелов суточного (2,90 × 105 и 12,98 × 105 имп. за 90 мин) и 240-суточного (2,90 × 105 и 8,17 × 105 имп. за 90 мин) возраста. Аналогичная зависимость отмечена при генерации люминолзависимых АФК. Минимальный объем вторичных радикалов при спонтанной и индуцированной хемилюминесценции у суточных перепелов составил 1,11 × 105 и 1,88 × 105 имп. за 90 мин соответственно, а у птицы 240-суточного возраста – 0,39 × 105 и 1,14 × 105 имп. за 90 мин. У старых перепелов светосумма всех видов индуцированной и спонтанной продукции АФК либо не отличалась от исходных показателей, либо на 20–60 % отставала от них (рис. 1), вероятно, это свидетельствует или о низких функциональных возможностях фагоцитов крови у только что вылупленных и старых перепелов, или о высокой активности антиоксидантной защиты организма.

Рис. 1. Относительные показатели суммарных объемов люцигенин- и люминолзависимой хемилюминесценции при спонтанной и активированной продукции АФК клетками крови перепелов (% к исходным данным суточной птицы)

Высокий уровень генерации свободных кислородных радикалов установлен у перепелов 14-, 30-, 60-, 90-суточного возраста. Межвозрастные отличия в этот период жизни птицы характеризовались недостаточной степенью достоверности вследствие высокой вариабельности полученных показателей. Максимальные значения суммарной продукции антигениндуцированных люцигенинзависимых радикалов зарегистрированы у птицы двухнедельного возраста, люминолзависимых АФК – у двухмесячных перепелов (Р ≤ 0,05). Светосумма люцигенинзави-симых радикалов при спонтанной ХЛ у перепелов 14–90-суточного возраста в 5,5–7 раз превысила исходные показатели суточной птицы (рис. 1). Продукция спонтанных люминолзависи-мых радикалов отличалась крайне низкими показателями, особенно на 30-е и 240-е сут жизни.

Во все периоды исследования суммарная генерация первичных люцигенинзависимых АФК клетками цельной крови перепелов значительно превышала продукцию вторичных лю-минолзависимых радикалов как в состоянии покоя, так и при антигенном раздражении клеток частицами латекса. При активированной ХЛ-реакции объемы люцигенинзависимых АФК превысили показатели люминолзависимых свободных радикалов в 5,6–13,3 раза (Р ≤ 0,01), при спонтанной ХЛ-реакции – в 2,6–18,2 раза (Р ≤ 0,01). Причем минимальные отличия в соотношении люминол- и люцигенинзависимых АФК отмечены у суточной и 240-суточной птицы. Аналогичные особенности спектра свободных кислородных радикалов установлены Г.В. Ма-карской и соавторами при исследовании хемилюминесценции клеток цельной крови у кур [8].

При использовании люцигенина и люминола в качестве ХЛ-зондов выявлено заметное отличие амплитуды активности продукции первичных и вторичных АФК. Показатели интенсивности активированной и спонтанной люцигенинзависимой реакции в несколько раз превышали параметры люминолусиленной ХЛ во все периоды исследования. Особенно ярко это проявлялось у 90-суточных перепелов (в 15–18 раз), менее выражены отличия – у птицы суточного и 240-суточного возраста. Амплитуда максимальной активности люцигенинзависимой ХЛ достигала пиковых показателей у перепелов 90-суточного возраста, превышая исходные величины при спонтанной реакции в 5,9 раза, при индуцированной – в 8,7 (Р ≤ 0,05).

Для люминолзависимой ХЛ была характерна низкая амплитуда максимальной активности как при спонтанной, так и при антигенактивированной реакции во все возрастные периоды. Интенсивность спонтанной люминолзависимой реакции колебалась в пределах 30–43 имп./с, а при активированной ХЛ – от 85 имп./с у суточных перепелов до 214 имп./с – у птицы двухмесячного возраста.

Самый быстрый выход хемилюминесцентной кривой на максимум (12–13 мин) наблюдался у двух- и трехмесячной птицы при индуцированной люцигенин- и люминолусиленной ХЛ. Однако спонтанная генерация всех видов АФК отличалась крайне медленным течением, о чем свидетельствовало выраженное смещение пика хемилюминесцентной кривой вправо, особенно у перепелов 14-, 30- и 60-суточного возраста. Так, у двухмесячной птицы максимальная интенсивность продукции спонтанных люминолзависимых радикалов зарегистрирована на 64 мин, люцигенинзависимых – на 82 мин, это в 5–6 раз выше показателей индуцированной частицами латекса ХЛ-реакции у птицы аналогичного возраста (Р ≤ 0,01). С момента достижения максимума хемилюминесценции и до окончания регистрации кинетики хемилюминесцентной кривой интенсивность выхода спонтанных АФК превышала показатели индуцированной реакции, наиболее ярко это проявилось у 30- и 60-суточных перепелов. Очевидно, что при антигенной активации in vitro частицами латекса в клетках, наряду с проокси-дантными реакциями, запускаются и ферментные механизмы антиоксидантной защиты, «гасящие» образование свободных радикалов.

По окончании регистрации хемилюминесцентной реакции определяли фагоцитарную активность лейкоцитов крови как соотношение количества клеток с частицами латекса в цитоплазме к общему содержанию лейкоцитов, выраженное в процентах. Общее содержание лейкоцитов колебалось от 9,99 ± 1,27 × 109 кл./л до 12,82 ± 1,43 × 109 кл./л. Минимальное содержание лейкоцитов (4,76 ± 0,43 × 109 кл./л) зарегистрировано у старых перепелов. При исследовании возрастных особенностей фагоцитарной активности лейкоцитов крови показаны минимальные величины данного параметра у суточных перепелов (15,6 ± 3,6 %), указывая на крайне низкие функциональные способности клеток к ответной реакции на раздражение частицами латекса (рис. 2). Спустя две недели показатель вырос более чем в 2 раза, а у птицы двух- и трехмесячного возраста достиг максимальных величин, в 4,26–4,36 раза превысив исходные данные. Относительно высокий уровень фагоцитарной активности лейкоцитов (51,67 ± 7,26 %) сохранялся до конца наблюдений.

А

Б

Рис. 2. Фагоцитарная активность (ФА) лейкоцитов крови перепелов: А – возрастные изменения ФА относительно показателей суточной птицы, %; Б – фагоцитоз частиц латекса лейкоцитом крови.

Возраст – 60 сут. Окраска 0,25 %-ным генцианвиолеттом, ув. × 400

Полученные в ходе ХЛ-реакции цифровые данные позволили рассчитать удельную антигениндуцированную продукцию свободных радикалов кислорода на один лейкоцит и активированный частицами латекса фагоцит крови (таблица). Для возрастных особенностей показателя характерен достоверный рост удельной антигенактивированной люцигенинзависимой генерации АФК лейкоцитами у 14–90-суточной птицы по сравнению с показателями суточных и старых перепелов. Удельная продукция первичных АФК активированными фагоцитами у двухнедельных перепелов превысила исходные данные в 2 раза, однако вследствие высокой вариабельности значений данные показатели не отличались высокой достоверностью. В последующем показатель сокращался, особенно значимое падение отмечено на 60-е и 240-е сутки.

Удельная продукция люминолзависимых свободных радикалов лейкоцитами крови на 14-е сутки жизни выросла почти в 2 раза, а активированными фагоцитами – лишь на 17,7 % (таблица). В дальнейшем показатель сокращался на 50–60 % относительно исходных данных и достиг минимальных величин у птицы 90-суточного возраста.

Возрастные показатели удельной генерации АФК лейкоцитами и фагоцитами крови перепелов при хемилюминесценции, активированной частицами латекса, имп./кл.

Возраст, сут	Люминол		Люцигенин
	S/лейкоцит	S/фагоцит	S/лейкоцит	S/фагоцит
1	0,33 ± 0,25	1,92 ± 0,24	1,77 ± 0,50	13,56 ± 3,20
14	0,73 ± 0,15	2,26 ± 0,36	7,63 ± 2,17*	27,52 ± 8,71
30	0,58 ± 0,19	1,00 ± 0,25**	5,15 ± 1,10**	9,66 ± 2,24
60	0,60 ± 0,16	0,89 ± 0,25**	4,50 ± 1,05**	6,93 ± 1,90
90	0,53 ± 0,16	0,78 ± 0,22**	6,32 ± 1,14**	9,54 ± 2,04
240	0,61 ± 0,22	1,18 ± 0,44	3,46 ± 1,06	7,24 ± 3,01

Примечание: *Р ≤ 0,05; **Р ≤ 0,01 по сравнению с показателями суточной птицы.

Немаловажное значение в оценке свободнорадикальных процессов, протекающих в организме, имеет показатель индекса активации. Определяют его отношением суммарной продукции индуцированных и спонтанных АФК; он указывает на потенциальные возможности лейкоцитов к генерации «респираторного взрыва» при антигенной стимуляции. Нами установлено, что у суточных перепелов индекс активации при образовании первичных люцигенинзави-симых радикалов в два раза выше, чем при использовании люминола в качестве ХЛ-зонда, т.е. 3,8 и 1,9 усл. ед. соответственно. Однако в дальнейшем показатели продукции первичных люцигенинзависимых АФК сократились на 19–52 % относительно исходных данных, а при люминолзависимой ХЛ – увеличились на 68–84 %, достигая пиковых значений у птицы 240-суточного возраста при наименьшей суммарной продукции спонтанных и активированных АФК.

Заключение

Установлено преобладание генерации люцигенинзависимых кислородных радикалов клетками цельной крови перепелов как в спонтанном, так и в антигенактивированном состоянии. Минимальная суммарная продукция всех форм свободных радикалов отмечена у перепелов суточного и 240-суточного возраста. Максимальные значения светосуммы антигениндуциро-ванных люцигенинзависимых радикалов зарегистрированы у птицы двухнедельного возраста, люминолзависимых АФК – у двухмесячных перепелов. Антигенная стимуляция фагоцитов крови частицами латекса сокращает время достижения максимума хемилюминесценции в 5–7 раз. Полученные данные дополняют сведения о механизмах неспецифической резистентности организма перепелов и имеют теоретическое и прикладное значение в биологии и ветеринарии.