Вспомогательные репродуктивные технологии в животноводстве как источник стресса: мини-обзор

Из-за изменений климата и применения интенсивных технологий в сельскохозяйственном производстве растет число факторов, оказывающих стрессорное воздействие на животных (1-3). Согласно Гансу Селье (Hans Hugo Bruno Selye, 1907-1982), стресс — это совокупность направленных на адаптацию к меняющимся условиям, неспецифических реакций организма на действие раздражителей (стрессоров) (4). Единая классификация видов стресса в настоящее время отсутствует, и вид стресса определяется типом индуцирующих его факторов. К основным видам стресса, приводящим к снижению продуктивности животных и подавлению их воспроизводительной функции, относят тепловой (1, 2, 5, 6), кормовой (2, 6), социальный (3), транспортировочный (2, 5), отъемочный (2), болевой (1, 5), а также вакцинацию (7). В зависимости от интенсивности, продолжительности воздействия неблагоприятных факторов и ответа на стимул стресс подразделяют на острый, эпизодический острый и хронический (8, 9).

С интенсификацией животноводства связано повсеместное применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), включающих как манипуляции с половыми клетками и эмбрионами, так и выполнение процедур, которым подвергаются животные: искусственное осеменение,

^∗ Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (Государственное задание ¹ FGGN-2024-0014).

получение эмбрионов in vivo вымыванием из половых путей самок, прижизненное получение ооцитов посредством трансвагинальной аспирации фолликулов (ovum pick-up, OPU) с их последующим оплодотворением и культивированием для получения эмбрионов in vitro (in vitro production, IVP) (10-12). Такие технологии позволяют повышать интенсивность селекции, сохранять генофондные породы, ускорять процесс обновления и качественного улучшения стада (11-14). Однако число работ, посвященных анализу стрессорного воздействия перечисленных технологий на сельскохозяйственных животных, крайне ограничено, особенно в области OPU, поскольку эта процедура считается относительно новой и широко применяется не так давно (15).

В представленном обзоре обобщена информация о стресс-индуци-рующем влиянии вспомогательных репродуктивных технологий и о последствиях стресса для эффективности ВРТ.

Гормональные и метаболические маркеры стресса. Согласно современному представлению, выделяют две основные реакции на стресс. Быстрая реакция происходит при участии симпатической нервной системы и сопровождается синтезом и секрецией катехоламинов — адреналина и норадреналина, медленная обусловлена активацией гипоталамо—ги-пофизарно—надпочечниковой оси (ГГНО) и ведет к выделению кортикостероидов корой надпочечников (3, 9).

К числу биомаркеров, по соотношению которых у животных определяют состояние стресса, относят концентрацию катехоламинов и глюкокортикоидов, белков острой фазы воспаления (гаптоглобина, сывороточного амилоида, параоксоназы-1), количество плазменных белков и соотношение альбуминов и глобулинов, фактора некроза опухоли- α и интерлейкина-6, активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантных белков (6, 1618). Наиболее распространенным методом диагностики стресса у животных является определение концентрации кортизола (кортикостерона у мышей) в плазме или сыворотке крови, а также неинвазивные методы оценки содержания этого гормона в слюне, моче, кале, шерсти, молоке (19-21). Соотношение детектируемых аналитов во многом определяется типом стресса — острым или хроническим (22). Таким образом, имеется обширный перечень чувствительных биомаркеров, но для формирования объективной оценки благополучия животных необходим комплексный анализ нескольких индикаторов, включая особенности поведения (3).

Факторы стресса при применении репродуктивных технологий. Манипуляции с животными и проявления стресса . Среди ВРТ наиболее ранним и широко применяемым считается искусственное осеменение (23). По данным V. Ferreira с соавт. (24), выполнение этой процедуры не ведет к повышению уровня кортизола в крови животных. Тем не менее среди возможных причин стресса при искусственном осеменении рассматривают фиксацию животных, в связи с чем ведется поиск оптимальных условий их обездвиживания (25).

Неотъемлемый этап ВРТ — ректальная пальпация, которую проводят с целью определения фазы эстрального цикла, диагностики стельности и патологических состояний (26, 27). Данные о стрессорном влиянии ректального обследования противоречивы. Так, по мнению ряда исследователей, процедура обладает выраженным стрессорным воздействием, о чем свидетельствуют повышенные концентрации кортизола (28, 29), увеличение частоты сердечных сокращений (30) и проявление реакций избегания (31) во время и после выполнения манипуляции. Другие исследователи не выявили нарастания выраженности признаков стресса у животных до и после обследования (32, 33).

Прижизненное получение ооцитов от самок крупного рогатого скота с помощью трансвагинальной аспирации фолликулов — современная технология, позволяющая использовать одно животное для выделения большого числа репродуктивных клеток и, как следствие, увеличения числа генетически охарактеризованных эмбрионов (34). Однако такая техника предполагает многократное воздействие на влагалище и яичники: в большинстве случаев OPU выполняют дважды в неделю в течение по меньшей мере 2 мес (35-37).

Обследование телок — доноров ооцитов при OPU показало, что эта процедура служит индуктором стресса у животных, причем частота сердечных сокращений и концентрация кортизола в плазме крови увеличиваются уже при иммобилизации доноров и сохраняются повышенными относительно показателей в состоянии покоя в течение всех последующих этапов: проведения эпидуральной анестезии, введения системы для OPU во влагалище животного, пункции фолликулов (36), а также в течение 15 мин после окончания сессии OPU (37). Кроме того, обнаруживались поведенческие признаки дискомфорта телок, в частности отказ от корма во время иммобилизации и введения иглы для эпидуральной анестезии (36). Важно отметить, что концентрация кортизола в крови коров при пункции фолликулов была соизмерима с таковой у животных, которым выполняли эпидуральную анестезию без последующей пункции (37). Следовательно, процедуру анестезии можно рассматривать как наиболее значимый стрессорный фактор при выполнении OPU, по всей видимости, из-за выраженного болевого синдрома (38).

Исследование S. Chastant-Maillard с соавт. (37) на коровах голштинской породы не выявило зависимости между динамикой концентрации кортизола в плазме крови (перед, во время и после получения ооцитов) и сессией OPU при проведении двух еженедельных процедур в течение 8 нед. В другой работе (36) показано, что статистически значимое повышение концентрации кортизола в крови животных происходит в конце 4-месячного периода применения этой процедуры (36). Следовательно, необходимо рассчитывать оптимальную продолжительность использования доноров, чтобы избежать их длительного нахождения в состоянии стресса.

Тепловое воздействие как дополнительный фактор стресса. Тепловой стресс находится в фокусе внимания исследователей по причине происходящих климатических изменений (39). Его влияние на физиологию, продуктивность и воспроизводство животных изучено подробно (39-42). Вследствие воздействия высоких температур происходит нарушение полового поведения (в частности, животные не проявляют признаков эструса) (43). Нарушается формирование преантральных фолликулов, уменьшается размер доминантного фолликула на фоне увеличения числа крупных недоминантных фолликулов (44). Число эмбрионов, развивающихся до стадии бластоцисты, при оплодотворении ооцитов от животных, подвергшихся воздействию теплового стресса, снижается, что свидетельствует о неудовлетворительном качестве репродуктивных клеток (45, 46).

Нарушение фолликулогенеза ведет к снижению синтеза эстрадиола (47). Угнетение отрицательной обратной связи ингибирования, вызываемое уменьшением размера доминантных фолликулов, повышает секрецию фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), что ведет к задержке овуляции, при этом низкая секреция прогестерона негативно отражается на функциональных характеристиках эндометрия и последующей имплантации (48). Также периоды высоких температур приводят к нарушению кровотока в матке (49)

и повышенной экспрессии мРНК простагландинов PGF-2 α и PGE2 в клетках эндометрия у коров (50), что может быть причиной выкидышей и бесплодия. Телки, рожденные от матерей, подвергшихся тепловому стрессу на ранних сроках стельности, имели меньший овариальный резерв и сниженную концентрацию антимюллерова гормона (51).

Восстановление фертильности, сопровождающееся появлением зрелых ооцитов с высокой компетенцией к эмбриональному развитию при оплодотворении, наступает лишь спустя 2-3 эстральных цикла после окончания периода повышенной температуры, чем подтверждается отрицательное влияние теплового стресса на самых ранних стадиях развития фолликулов (52).

Квалификация персонала . Вспомогательные репродуктивные технологии требуют непосредственного участия персонала. Непрофессиональное, невнимательное, недоброжелательное, грубое отношение персонала к животным оказывает выраженное стресс-индуцирующее воздействие (1, 5356). Напротив, контакт с людьми, которые у животного ассоциируются с положительными ощущениями, состоянием благополучия, снижает проявления стресса при выполнении процедур, вызывающих стресс (57). Особенно заметно повышение уровня маркеров стресса, когда манипуляции, связанные с ВРТ, проводит персонал, не обладающий соответствующим профессиональным опытом в достаточном объеме (29). В животноводческой практике существуют способы снижения уровня стресса у сельскохозяйственных животных, включающие поглаживание различных частей тела, разговор спокойным голосом, чистку щеткой, кормление (57-59). Показано, что коровы помнят позитивный опыт общения с человеком в течение 2 мес (58). Вероятно, память о стрессорном воздействии, вызванном ненадлежащим отношением персонала к животным, сохраняется в течение схожего временного периода.

Снижение эффективности ВРТ как следствие стресса. К вероятным причинам меньшего числа положительных репродуктивных исходов при ВРТ в настоящее время относят недостаточный ответ животных на гормональную стимуляцию (60, 61), низкую оплодотворяемость (62), нарушение имплантации эмбрионов и аборты (63). Один из важнейших этапов, определяющих эффективность ВРТ, — манипуляции с репродуктивными клетками, включающие созревание, оплодотворение и культивирование с целью получения эмбрионов и их последующего развития (11, 12, 62). Поэтому успех ВРТ во многом определяется качеством репродуктивных клеток (64, 65). Подавляющее большинство исследований влияния стресса на половой цикл, качество репродуктивных клеток, а также качество, жизнеспособность и имплантацию IVP эмбрионов проведены на грызунах как наиболее удобных модельных объектах для изучения стресс-индуцирующего воздействия внешних факторов в лабораторных условиях (66-70).

Регуляция полового цикла самок у млекопитающих осуществляется с участием пяти уровней: кора головного мозга, гипоталамус, гипофиз, яичники, матка. Гипоталамус выделяет гонадотропин-рилизинг-гормон (ГнРГ), который стимулирует переднюю долю гипофиза к выделению фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов (ФСГ и ЛГ). ФСГ поддерживает рост и развитие фолликулов в яичниках и выработку эстрогена, в то время как ЛГ инициирует овуляцию и синтез прогестерона (71). Показано, что активация ГГНО вследствие стрессорных воздействий подавляет функцию гипоталамо—гипофизарно—яичниковой оси (ГГЯО) преимущественно посредством ингибирования выработки ГнРГ с последующим снижением уровня гонадотропинов (72). Более того, одно из последствий стресса — 978

снижение секреции ЛГ в ответ на экзогенный ГнРГ (73), что имеет важное значение, например, при медикаментозной синхронизации эстрального цикла у коров.

Несмотря на имеющиеся данные об отсутствии корреляции между уровнем кортизола и половым поведением самок крупного рогатого скота (74, 75), показано, что у мышей кортизол способен подавлять развитие фолликулов, в особенности на поздних стадиях (76).

Наряду с нарушением фолликулогенеза, негативное влияние стресса выражается в снижении качества получаемых ооцитов. Так, хронический стресс при отсутствии влияния на число овулировавших ооцитов, может приводить к накоплению в них АФК, усилению апоптотических изменений в клетках кумулюса, а также снижать способность клеток к созреванию (65, 66, 77, 78), нарушать процесс мейоза в ооцитах (67, 68), сопровождаться нарушением связей между ооцитами и клетками кумулюса (68), вызывать аномалии веретена деления в ооцитах, что приводит к увеличению числа репродуктивных клеток низкого качества (67). При воздействии стресса в течение развития ооцитов у мышей с последующей гормональной стимуляцией снижается устойчивость репродуктивных клеток к старению (69).

Нарушение качества ооцитов вследствие воздействия стрессоров неизбежно ведет к изменению организации хромосом и кортикальных гранул (69), снижению оплодотворяемости и числа эмбрионов, развивающихся до стадии бластоцисты, и их вылупления (65, 70, 78, 79), а также уменьшению внутренней клеточной эмбриональной массы и ее соотношения с массой трофэктодермы (79).

F. Wahl с соавт. (80) показано, что кортизол вызывает многочисленные изменения в клетках эпителия яйцевода крупного рогатого скота: меняются их морфология (увеличивается число вакуолей, происходит децилиация, формируются многослойные участки) и трансэпителиальный биоэлектрический потенциал, снижается экспрессия мРНК провоспалительных цитокинов (интерлейкина 33 и интерлейкина 6), рецепторов к глюкокортикоидам, эстрогену и прогестерону и усиливается экспрессия гена проапоптотического фактора BAX , что ведет к изменению функциональных характеристик этой области, являющейся первым местом контакта эмбриона с организмом матери.

Имплантация эмбриона — важнейший этап, определяющий успех репродуктивных технологий. Существует подтверждение того, что у коров с более высоким уровнем кортизола в крови статистически значимо снижается частота наступления стельности после искусственного осеменения (81). Воздействие стрессоров может расцениваться как абортогенный фактор, что во многом обусловлено взаимодействием гормонов, связанных со стрессом, и иммунокомпетентных клеток, вызывающим нарушение баланса секретируемых провоспали-тельных и противовоспалительных цитокинов (82).

Показано, что существует так называемое стресс-чувствительное окно имплантации, и не всегда воздействие стрессоров при наступлении беременности приводит к неэффективной имплантации (70). В этом же исследовании приведены данные о снижении экспрессии гепаринсвязывающего ЕGF-по-добного фактора роста в эндометрии у мышей, подвергавшихся стрессу, что оказывает негативное влияние на последующую децидуализацию матки. Авторы (70) делают вывод о том, что стресс откладывает реакцию прикрепления, ингибируя активацию бластоцисты, и осложняет процесс имплантации, препятствуя вылуплению эмбриона (70).

Интенсивность реакции на воздействие стрессоров во многом определяется темпераментом особи (17, 81, 83). Отмечено наличие связи между возбудимостью и уровнем кортизола в сыворотке крови коров (81, 84, 85). Частота наступления стельности после искусственного осеменения и при трансплантации эмбрионов была значительно выше у спокойных реципиентов, чем у легковозбудимых (83, 86). Овуляция у более темпераментных животных сопровождается формированием желтого тела на месте небольших фолликулов, что ведет к недостаточной выработке прогестерона и, как следствие, к неэффективному поддержанию развития эмбриона на ранних стадиях (83, 84).

На модельных животных было показано, что половые различия играют заметную роль в механизмах и последствиях стресса: по сравнению с самцами грызунов самки проявляют более сильную нейроэндокринную реакцию на стресс (87, 88). Эта реакция может быть гормонально зависимой, поскольку более высокий уровень эстрогена связан с более сильными реакциями на стрессорные воздействия (89).

В то время как хронический стресс приводит к выраженному нарушению как мужской, так и женской репродуктивной функции (90, 91), краткосрочный стресс чаще всего не вызывает негативных последствий. Так, гормоны, выделяемые во время стресса, служат частью гормонального каскада при отеле у коров (92). Фолликулярная жидкость коров содержит кортизол в концентрации 12-20 нг/мл, которая значимо не меняется в течение эстрального цикла (93). Показано также, что этот гормон способен индуцировать пролиферацию эпителиальных клеток эндометрия крупного рогатого скота (94).

Краткосрочный стресс способен вызывать повышение подвижности и концентрации спермиев в эякуляте быков (90), а увеличение концентрации кортизола в сыворотке крови быков-производителей коррелирует с ростом оплодотворяющей способности сперматозоидов из таких эякулятов (95).

Итак, помимо общеизвестных стресс-индуцирующих факторов, связанных с условиями содержания животных и технологиями производства животноводческой продукции, в настоящее время имеет место стрессорное воздействие процедур, лежащих в основе вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). При использовании ВРТ следует принимать во внимание наличие факторов (например, тепловой стресс, недостаточная квалификация персонала), усугубляющих неблагоприятное воздействие самих манипуляций. Хронический стресс обладает ярко выраженным негативным влиянием на эффективность репродуктивных технологий, в то время как краткосрочное воздействие стрессоров не приводит к подавлению фертильности. Для совершенствования ВРТ необходим комплексный подход к выявлению факторов, ингибирующих воспроизводительную функцию животных, основанный на анализе условий содержания доноров и реципиентов, а также процедур, индуцирующих у них стрессовые реакции.