Выбор условий ферментативного гидролиза коллагенсодержащего сырья

Для остановки разрушения хрящевой ткани и восстановления ее структуры с успехом применяются хондропротекторы – препараты, действие которых направлено на питание и образование новых клеток хрящевой ткани, а также на выработку синовиальной жидкости – смазки сустава [6, 8].

К соединениям, обладающим хондропротекторными свойствами, относят гликозаминогликаны. В организме они тесно связаны пептидной связью с белком коллагеном. На данный момент сырьем для выделения гликозаминогликанов являются в основном экстракты хрящей крупного рогатого скота, акульего хряща, мидий.

В связи с перспективами использования соединений хондропротекторов для терапии и профилактики заболеваний опорно-двигательного аппарата [12] большой интерес проявляется к способам получения гликозаминогликанов из более дешевого биологического коллагенсодержащего сырья, например, соединительной ткани: шкура, сухожилия, хрящи [3].

Известные на сегодняшний день способы выделения гликозаминогликанов предполагают выделение гликозаминогликанов из сырья путем ферментативного гидролиза папаином или пепсином, осаждение гликозаминогликанов и сушку. Однако данные способы имеют определен- ные недостатки: технологии продолжительны по времени (более 48 ч), использование одного фермента не обеспечивает максимального выхода гликозаминогликанов, а сырье, в большей степени используемое для выделения, является достаточно дорогим (роговица глаза, акулий хрящ и др.).

Цель исследования : подобрать параметры ферментативного гидролиза коллагенсодержащего сырья для достижения высоких значений степени гидролиза с последующим выделением из него гликозаминогликанов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи : подобрать ферментные препараты для гидролиза сырья, определить фермент-субстратное соотношение ферментов, продолжительность, температуру и рН процесса.

Объекты и методы исследования . Сырьем для выделения гликозаминогликанов являлось коллагенсодержащее сырье – свиные хрящики.

Для проведения ферментативного гидролиза использовали коммерческие ферментные препараты трипсин и химотрипсин (ООО «Самсон-Мед»), полученные из поджелудочной железы КРС; папаин, полученный из дынного дерева Carica papapya (AppliChem); коллагеназа КК, полученная из промысловых видов крабов (Тихоокеанский институт биоорганической химии), которые в разной степени расщепляют коллаген, а также его связи с углеводами.

Оптимальные условия действия данных ферментов, согласно прилагаемой инструкции по пользованию, представлены в таблице 1 [5, 7, 9, 10].

Таблица 1

Фермент	Протеолитическая активность, ед/г	Оптимальное значение рН	Оптимальные значения температуры, о С
Папаин	270	5,0–7,2	37–40
Трипсин	223	7,8–8,5	37–40
Химотрипсин	1320	7,0–8,5	37–40
Коллагеназа	250	6,5–7,8	37–45

Оптимальные условия действия ферментных препаратов

Содержание белка в исходном сырье определяли по ГОСТ 25011, содержание жира – по ГОСТ 23042, содержание влаги – по ГОСТ 333189, содержание общей золы – по ГОСТ 31727 (ISO 936:1998).

Содержание общего азота, аминного азота в негидролизованном сырье и полученных гидролизатах определяли по методу Дюма на Rapid N cube.

Степень гидролиза (СГ), %, белка определяли по формуле

(Маа -МааЛ

СГ = ( -А ) х 100%,

\МоА - М АА0/ где NОА – содержание общего азота, %; NAA0 – содержание аминного азота в негидролизованном сырье, %; NAА – содержание аминного азота в гидролизате после гидролиза в течение некоторого периода времени, %.

Результаты исследования и их обсуждение . Для оценки потенциальных возможностей используемого сырья был проведен анализ его химического состава. Полученные результаты химического состава свиного хрящика представлены в таблице 2.

Химический состав свиного хрящика, %

Таблица 2

Показатель	Массовая доля, % на 100 г
Белок	29,4±1,47
Жир	4,6±0,23
Влага	64,3±3,22
Зола	1,7±0,06

Как видно из результатов таблицы 2, выбранное сырье на 30 % состоит из белка. При этом из литературных данных известно [2, 3], что вышеуказанное сырье содержит в составе различные гликозаминогликаны, представленные не в свободном виде, а как раз тесно связанные с белком коллагеном.

Для выделения гликозаминогликанов из сырья использовали ферментативный гидролиз.

Отечественный и мировой опыт свидетельствуют о целесообразности применения ферментных препаратов растительного, животного и микробиологического происхождения, обладающих протеолитической активностью и способных гидролизовать белки мяса и коллагенсодержащих отходов с повышенным содержанием соединительной ткани.

Для проведения ферментативного гидролиза свиные хрящики подвергали обезжириванию, промывали теплой водой, взвешивали и измельчали механическим способом до размеров кусочков не менее 1 мм.

Для более полного воздействия ферментов на сырье и повышения выхода гликозаминогликанов измельченное и очищенное сырье промывали 0,1 М фосфатным буфером при температуре 60–65 оС в течение 30 мин.

На первоначальном этапе, для того чтобы подобрать условия ферментативного гидролиза свиных хрящиков, необходимо было подобрать наиболее эффективный ферментный препарат, из указанных в таблице 1.

В качестве критерия эффективности ферментных препаратов использовали степень гидролиза белка, которую оценивали по динамике накопления аминного азота. Гидролиз проводили в оптимальных для каждого ферментного препарата условиях. Результаты приведены на рисунке 1.

Наиболее полно процесс гидролиза проходил под действием ферментных препаратов папаина и коллагеназы, которые были выбраны для дальнейших исследований.

1 – папаин; 2 – коллагеназа; 3 – трипсин; 4 – химотрипсин

Рис. 1. Динамика степени гидролиза белка выбранными ферментами

В период от 3 до 4 часов происходит незначительное увеличение степени гидролиза, в связи с этим проведение ферментативного гидролиза более 4 часов не целесообразно.

Далее определяли фермент-субстратное соотношение, продолжительность процесса и рН.

Из литературных данных известно, что эффективность действия ферментных препаратов в значительной степени зависит от соотношения фермент – субстрат . Поэтому изначально проводились исследования по выбору концентраций ферментных препаратов. Результаты представлены на рисунке 2, 3.

Концентрация, ед/г: 1 – 50; 2 – 100; 3 – 150; 4 – 200

Рис. 2. Динамика степени гидролиза белка папаином при различных концентрациях фермента

Продолжительность, мин

Концентрация, ед/г: 1 – 50; 2 – 100; 3 – 150; 4 – 200

Рис. 3. Динамика степени гидролиза белка коллагеназой при различных концентрациях фермента

Согласно представленным результатам (рис. 2, 3) видно, что наибольшая степень гидролиза 63 и 60 % достигается при использовании папаина с концентрацией 200 ед/г субстрата и коллагеназы с концентрацией 200 ед/г субстрата соответственно.

Далее подбирали значения рН действия фермента на коллагенсодержащее сырье. Результаты представлены на рисунках 4, 5.

Согласно полученным данным, максимальное значение степени гидролиза достигается: для папаина – при рН 6,5, температуре 37–40 оС, концентрации 200 ед/г; а для коллагеназы – рН 7,5, температуре 37–40 оС, концентрации 200 ед/г.

рН: 1 – 5,5; 2 – 6,0; 3 – 6,5; 4 – 7,0; 5 – 7,5

Рис. 4. Динамика степени гидролиза белка папаином при различных значениях рН

Продолжительность, мнн

рН: 1 – 6,0; 2 – 6,5; 3 – 7,0; 4 – 7,5; 5 – 8,0

Рис. 5. Динамика степени гидролиза белка коллагеназой при различных значениях рН

В ходе эксперимента также было необходимо установить, в каком случае, при единовременном или последовательном внесении выбранных ферментов, значение степени гидролиза будет максимальным.

При единовременном внесении папаина и коллагеназы проводили гидролиз в течение 8 ч при средних значениях для обоих ферментов рН – 7,0 и температуре – 40

оС. При последовательном внесении ферментов сначала проводили гидролиз при установленных условиях в течение 4 ч коллагеназой (рН – 7,5, температура – 40 оС), а затем вносили папаин и еще в течение 4 ч проводили гидролиз, при этом изменяя рН до 6,5 путем добавления фосфатного буфера. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Единовременное внесение ферментов		Последовательное внесение ферментов
Продолжительность, мин	Степень гидролиза, %	Продолжительность, мин	Степень гидролиза, %
60	23	60	35
120	33	120	49
180	45	180	62
240	57	240	70
300	60	300	75
360	60	360	78
420	60	420	78

Динамика степени гидролиза белка при единовременном и последовательном добавлении ферментов

Из результатов таблицы 3 видно, что при единовременном добавлении ферментов степень гидролиза белка достигает всего 60 %, при этом последовательное добавление ферментов приводит к повышению эффективности ферментативного гидролиза до 75–76 %.

Выводы. В результате проведенного исследования было установлено, что условиями ферментативного гидролиза, обеспечивающими максимальное значение степени гидролиза, являются проведение гидролиза коллагенсодержащего сырья сначала ферментом коллагеназой при рН 7,5 и температуре 40 ^оС в течение 3 часов, а затем 3 часа папаином при рН 6,5 и температуре 40 ºС при постоянном перемешивании (последовательное внесение ферментов). Степень гидролиза при этом составляет 77– 78 %. Общая продолжительность процесса составляет 6 часов, так как увеличение продолжительности гидролиза не приводит к повышению степени гидролиза белка.

Результаты исследования будут использованы в дальнейшем для подбора параметров осаждения, фрак- ционирования, распылительной сушки растворов и определения хондропротекторных свойств, выделенных гликозаминогликанов.

Работа выполнена в рамках договора 9214ГУ/2015 при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере .