Выделение и химическая характеристика пектиновых полисахаридов из плодов калины саржента Viburnum sargentii Koehne

Целлюлоза, гемицеллюлозы и пектиновые полисахариды являются главными компонентами растительной клеточной стенки. Пектиновые полисахариды совместно с гемицеллюлозами образуют матрицу, в которую встроены микрофибриллы целлюлозы. Взаимодействие между полисахаридами обеспечивает не только устойчивые, но и динамичные и гибкие свойства клеточной стенки [1, 2]. Среди полисахаридов клеточных стенок высших растений пектиновые полисахариды являются наиболее сложными и интересными с точки зрения структурной организации и функциональной активности. Они выполняют различные биологические функции в растениях [2] и обладают разноплановой физиологической активностью [3]. Расширение знаний о различии пектиновых полисахаридов растений разных видов и о влиянии условий их произрастания необходимо для понимания функций и роли этих биополимеров в растительной клетке.

В данной работе проведено сравнение пектиновых полисахаридов, выделенных из плодов калины Сар-жента Viburnum sargentii Koehne (сем. Caprifoliaceae) , произрастающей в умеренном муссонном климате Дальнего Востока, и ранее выделенных и охарактеризованных пектиновых полисахаридов плодов калины обыкновенной Viburnum opulus L., произрастающей в континентальном климате Башкортостана [4]. Проведенные сравнительные исследования плодов дальневосточного и европейского видов калины показали сходство качественного и количественного содержания флавоноидов, антоцианов, катехинов, органических, амино- и жирных кислот [5]. Вместе с тем выявлено различие в количественном содержании оксикоричных кислот [5].

Материалы и методы

Растительный материал. Плоды калины Саржента были собраны в сентябре 2011 г. на территории Амурской области в окрестностях г. Белогорска. После предварительного подвяливания вы- сушены с применением инфракрасной сушки и измельчены до частиц размером 3 мм.

Общие аналитические методы. Определение количественного содержания белка проведено методом Лоури [6], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (БСА). Общее содержание гликуроновых кислот уточняли спектрофотометрическим методом по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии концентрированной серной кислоты [7]. Для построения калибровочной кривой использовали галактуроновую кислоту. Определение степени метилэтерификации проводили по методу, описанному ранее [8], используя метиловый спирт в качестве стандарта. Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре марки Ultrospec 3000 (Pharmacia Biotech, England).

Для определения количественного содержания нейтральных моносахаридов в гидролизатах использован метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе Varian 450-GC (США) с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке VF-5 ms (Varian, США; 0.25 мм, 30 м), газ-носитель - гелий. Температурный режим: от 175 ° C (1 мин) до 250 ° C (2 мин) со скоростью 3 ° С/мин.

Для распределительной нисходящей бумажной хроматографии (БХ) использовали систему растворителей н-бутанол : пиридин : вода (6:4:3) бумага Filtrak FN №3 (Германия). Идентификацию моносахаридов проводили с помощью раствора кислого анилинфталата при температуре 105 ° С. Для сравнения применялся стандарт, содержащий галактуроновую кислоту. Все растворы упаривали на ротационном испарителе марки Laborota 4002 (Heidolph, Germany) при пониженном давлении и температуре 40–45°С. Для лиофилизации водных растворов использовали лиофильную сушку марки VirTis (США).

Выделение вибурнанов. Сырье (700 г) предварительно обрабатывали хлороформом в аппарате Сокслета, сушили, заливали водой (4 л). Экстракцию проводили при 80°С в течение 5 ч. Остаток сырья отделяли центрифугированием. Экстракт концентрировали, диализовали против дистиллированной воды при 10°С в течение трех суток. Полученный диализат центрифугировали, концентрировали до 100 мл и при перемешивании выливали в 95%-ный этиловый спирт (300 мл). Осаждение полисахаридов проводили при 10°С в течение 3 ч. Полисахариды отделяли центрифугированием, осадок растворяли в дистиллированной воде (70 мл) и лиофилизовали. В результате получили фракцию VS1 с выходом 1.55%.

Остаток сырья заливали дистиллированной водой и подкисляли соляной кислотой до рН 4.0. Экстракцию проводили при 50°С в течение 5 ч. Экстракт обрабатывали, как описано выше. В результате получили фракцию VS2 с выходом 0.38%.

Остаток сырья заливали 0.5%-ным водным раствором оксалата аммония. Экстракцию проводили при 70°С в течение 5 ч. Экстракт обрабатывали по вышеописанной методике. В результате получили фракцию VS3 с выходом 0.40%.

Определение гомогенности вибурнанов. Для определения гомогенности выделенных полисахаридных фракций использовали метод ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе (Cl^—форма). Навеску полисахарида (80 мг) растворяли в дистиллированной воде (5 мл), наносили на колонку (40×2.7 см), элюирование проводили в изократи-ческом режиме водными растворами натрия хлорида возрастающей концентрации (0.01, 0.2, 0.3, 1.0 М). Разделение выполняли при скорости элюента 48 мл/час, отбирая фракции по 12 мл. Выход полисахаридных фракций контролировали по реакции элюата на углеводы по методу Смита [8]. Фракции, содержащие полисахариды, объединяли, концентрировали, диализовали и лиофилизовали. При разделении фракции VS1 получили полисахариды VS1-1, VS1-2, VS1-3, VS1-4; фракции VS2 – VS2-1 и VS2-2; фракции VS3 – VS3-1, VS3-2.

При определении средневесовой и среднечисловой молекулярной массы образцов использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используя хроматографическую систему (Shimadzu, Япония): насос LC-20AD, дегазатор DGU-20A 3 , рефрактометр RID-10A, термостат СТО-20A, колонку Shodex OHpak SB-804 HQ (8.0 мм × 30 см), предколонку Shodex GS-26 7В (7.6 мм × 5 см). Элюирование проводили 0.15 М NaCl (40 ° С, 0.3 мл/мин).

Полный кислотный гидролиз. Навеску полисахарида (2.5; 5 мг) нагревали 5 ч при 100°С с 2 М трифторуксусной кислотой (TFA) (1 мл), содержащей мио -инозит (0.5 и 1 мг/мл соответственно) в качестве внутреннего стандарта. Кислоту удаляли многократным упариванием с метанолом. Моносахариды восстанавливали и ацетилировали, после чего их идентифицировали методом ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов.

Ферментативный гидролиз. Навеску полисахарида (20 мг) растворяли в воде (20 мл), добавляли 1,4- a -D-полигалактуроназу (Sigma, USA) (5 мг), предварительно растворенную в 0.05 мл дист. воды. Смесь оставляли на ночь при комнатной температуре (25°С). Фермент дезактивировали кипячением при 100°С и удаляли центрифугированием. Раствор концентрировали до 10 мл и выливали в 96%-ный этиловый спирт (30 мл). Осадок отделяли центрифугированием. Спиртовой супернатант концентрировали и вычисляли наличие в нем галакту-роновой кислоты с помощью БХ.

Определение содержания белка, уроновых кислот и нейтральных моносахаридов, а также степени метилэтерификации проводили в трех параллельных измерениях. При обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение и среднее квадратичное отклонение. Достоверность результатов оценивали по t-критерию Стъюдента.

Результаты исследований

Из высушенных и обработанных хлороформом ягод калины Саржента последовательной экстракцией выделены фракции, содержащие растворимые пектиновые полисахариды (VS1), и пектиновые полисахариды, входящие в состав протопектинового комплекса

(VS2 и VS3). Пектиновые полисахариды составляют до 30% от сухой биомассы двудольных, голосеменных и однодольных растений [9] и входят в состав растительной клетки в двух формах – растворимой и нерастворимой (в составе протопектинового комплекса). Растворимые пектины локализованы в вакуоли и срединной пластине. Протопектиновый комплекс образует основу первичной клеточной стенки растений [10]. Выход фракции VS1 существенно выше, чем фракций VS2 и VS3 (табл. 1), что свидетельствует о превалирующем содержании в ягодах калины растворимых пектиновых полисахаридов. В онтогенезе растений происходят изменения в содержании пектинов и соотношении растворимых пектинов и протопектинов. В частности, при созревании плодов в них увеличивается количество растворимого пектина [11].

Считается, что пектиновые полисахариды имеют блочный характер строения углеводной цепи и чаще всего содержат три основных блока, в каждом из которых – остатки галактуроновой кислоты GalA в больших или меньших количествах [12]. Для подтверждения наличия 1,4- α -D-галакту-ронана в составе углеводных цепей полисахаридов выделенных фракций использовали метод ферментативного гидролиза 1,4- α -D-галактопиранозилуро-назой, избирательно гидролизующей 1,4-связи между остатками α -D-галактуроновой кислоты. Установлено, что ферментативный гидролиз приводит к значительной деструкции углеводных цепей полисахаридов, входящих в состав всех выделенных фракций (около 50%), которая сопровождается образованием свободной галактуроновой кислоты. Это доказывает принадлежность углеводной части

Таблица 1

Характеристика пектиновых фракций плодов калины Саржента

Фракция	Выход, %*	СМ**, %	Содержание, %***
			GalA	Ara 1	Gal 1	Rha 1	Xyl 1	Man	Glc 1	Белок
VS1	1.6	22.2±1.4	53.1±1.5	5.9±0.7	4.5±0.3	1.1±0.3	2.4±0.5	0.3±0.08	1.0±0.09	41.8±2.1
VS2	0.4	28.9±0.9	56.9±1.4	5.7±0.7	5.8±0.5	1.5±0.3	3.1±0.3	0.2±0.05	0.9±0.05	32.5±1.3
VS3	0.4	25.5±0.8	73.9±1.6	4.0±0.3	2.8±0.3	1.0±0.2	3.7±0.3	0.5±0.05	0.5±0.05	18.5±1.1

Примечание. * – от массы воздушно-сухого растительного материала; ** – степень метилэтерификации, показывает процент метилэтерифицированных остатков галактуроновой кислоты; *** – весовые проценты.

Выделенные полисахаридные фракции были охарактеризованы по моносахаридному составу, гомогенности и содержанию белка. Определение моносахаридного состава полисахаридов, входящих в состав выделенных фракций, проводили спектрофотометрическим методом и методом ГЖХ. Установлено, что из ягод калины Саржента экстрагируются кислые полисахариды, с типичным для пектинов моносахаридным составом, но различаются соотношением остатков галактуроновой кислоты и нейтральных моносахаридов (табл. 1). Спектрофотометрическим методом показано, что главным компонентом углеводной части всех выделенных фракций являются остатки галактуроновой кислоты (табл. 1). Методом ГЖХ после полного кислотного гидролиза фракций 2 М TFA и последующего получения ацетатов полиолов установлено, что доминирующими нейтральными моносахаридами всех фракций являются арабиноза (Ara), галактоза (Gal) и ксилоза (Xyl). Сравнение данных по t-критерию Стьюдента доказывает достоверность этого утверждения. В качестве минорных компонентов в составе углеводных цепей пектинов идентифицированы остатки рамнозы (Rha), маннозы (Man), глюкозы (Glc), общее содержание которых составляет менее 3%. Ранее показано, что при последовательной экстракции из ягод калины обыкновенной V. Opulus, наряду с пектиновыми полисахаридами, экстрагируются галактоманнаны, содержание которых составляет 0.1% от массы сухого растительного материала [4].

выделенных фракций к классу пектиновых полисахаридов. Установлено, что часть остатков галакту-роновой кислоты, входящих в область галактурона-на, метилэтерифицирована (табл. 1).

Ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе (Сl--форма) показано, что все полученные фракции гетерогенны по составу (табл. 2). Фракция VS1 включает четыре пектиновых полисахарида VS1-1, VS1-2, VS1-3 и VS1-4, которые элюируются 0.01, 0.2, 0.3 и 1.0 М растворами NaCl соответственно. Полученные пектины представляют собой полимергомологи и различаются содержанием остатков галактуроновой кислоты. Фракция VS1-1, элюирующаяся 0.01 М раствором NaCl, отличается повышенным содержанием остатков арабинозы и галактозы. Фракции VS2 и VS3 включают по два пектиновых полисахарида, характеризующихся высоким содержанием галактуроновой кислоты (табл. 2). Во всех фракциях, полученных ионообменной хроматографией, за исключением VS2-2, содержится белок, что может указывать на наличие ковалентной связи между углеводной и белковой составляющими.

При сравнении полученных результатов исследования полисахаридов, выделенных из ягод калины дальневосточного вида V. sargentii и данных по исследованию полисахаридов, выделенных ранее из ягод калины европейского вида V. opulus [4], установлено, что, экстрагируемые водой фракции включают пектиновые полисахариды со сходным моносахаридным составом, в то время как фрак-

Таблица 2

Характеристика пектиновых полисахаридов, полученных ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе

Фракция		С NaCl , М	Выход, %*	Содержание, %**
				GalA	Ara	Gal	Rha	Xyl	Man	Glc	Белок
VS1	VS1-1	0.01	21.7	28.1±1.1	12.1±0.6	12.1±0.6	2.4±0.3	1.9±0.2	0.5±0.06	1.4±0.2	25.6±1.6
	VS1-2	0.2	7.4	56.0±1.8	2.2±0.1	3.2±0.2	1.1±0.1	2.8±0.3	0.1±0.05	0.8±0.1	17.1±0.8
	VS1-3	0.3	12.0	63.6±2.4	1.1±0.06	1.1±0.15	0.7±0.08	0.5±0,1	0.2±0.05	1.0±0.1	3.1±0.1
	VS1-4	1.0	3.7	77.6±2.3	2.6±0.1	1.7±0.2	0.6±0.08	0.6±0.1	0.2±0.05	0.6±0.08	10.6±1.2
VS2	VS2-1	0.2	21.5	77.0±2.3	5.2±0.2	4.7±0.3	1.3±0.15	5.8±0.5	0.2±0.05	0.7±0.08	3.1±0.1
	VS2-2	0.3	27.9	87.5±2.8	1.4±0.09	1.7±0.15	0.6±0.07	2.7±0.3	0.1±0.05	0.4±0.05	0
VS3	VS3-1	0.1	13.4	62.5±2.1	3.8±0.2	3.9±0.2	0.5±0.05	2.0±0.3	0.2±0.05	0.8±0.09	8.1±0.8
	VS3-2	0.2	39.5	73.0±2.3	1.9±0.1	1.9±0.6	0.7±0.05	2.6±0.3	0.3±0.05	0.6±0.08	4.7±0.2

Примечание. * – от массы, нанесенной на колонку навески; ** – весовые проценты.

Таблица 3

ции, полученные экстракцией водным раствором соляной кислоты и оксалата аммония, существенно различаются. В состав фракций, выделенных из плодов калины обыкновенной, входят галактоманнаны [4], в то время как фракции, выделенные из плодов калины Саржента, содержат исключительно пектиновые полисахариды. Установленные различия в полисахаридном составе ягод калины могут быть связаны с видовой принадлежностью растений, условиями их произрастания, и с периодом вегетации и фазой роста калины. Выявление факторов, влияющих на содержание полисахаридов, требует дальнейшего исследования.

В составе всех выделенных фракций – значительное количество белка (до 21%). Присутствие белка во фракциях закономерно, поскольку белки входят в состав клеточной стенки растений наряду с полисахаридами и ароматическими соединениями [10]. Хотя ранее наличие белков в растительной клеточной стенке подвергалось сомнению [13]. К настоящему времени установлено, что белки входят в состав клеточной стенки и как структурные компоненты, и как ферменты [14]. Белки могут быть связаны с пектинами через боковые цепи RG-I посредством связей, образованных через остатки галактозы и арабинозы [15]. Такие сшивки обеспечивают клеточной стенке дополнительную структурную и функциональную прочность.

Для определения средневесовой (Mn) и среднечисловой (Mw) молекулярной массы использовали метод ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в табл. 3. Установлено, что все фракции характеризуются высокой степенью полидисперсности (Mw/Mn). Индекс полидисперсности фракции VS1 составил 43, VS2 – 21, VS3 – 23. На выходных кривых всех фракций наблюдается несколько пиков, характеризующихся различными молекулярными массами, что свидетельствует о гетерогенности выделенных фракций. Несмотря на то, что полученные полисахариды имеют низкую степень метилэтерификации остатков галактуроно-

Результаты ВЭЖХ анализа полисахаридных фракций

№ пика Площадь пика, % Mn, кДа Mw, кДа Mw/Mn VS1 (индекс полидисперсности – 43) 1 52.9 90.7 282.6 3.1 2 10.8 16.6 17.4 1.0 3 21.2 4.7 5.9 1.3 4 15.1 0.7 1.0 1.4 VS2 (индекс полидисперсности – 21) 1 94.7 22.0 206.9 9.4 2 5.3 0.8 1.0 1.2 VS3 (индекс полидисперсности – 23) 1 36.2 96.3 253.4 2.6 2 28.6 8.9 16.0 1.8 3 22.8 3.8 4.4 1.2 4 12.4 0.8 1.1 1.3 вой кислоты (табл. 1), относительно невысокая молекулярная масса входящих в состав фракций пектиновых макромолекул определяет их хорошую растворимость в воде.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлены различия полисахаридного состава ягод двух близкородственных видов калины – европейского и дальневосточного. В плодах калины Саржента и калины обыкновенной синтезируются близкие по моносахаридному составу пектиновые полисахариды. Однако в плодах дальневосточного вида не обнаружены галактоманнаны, наличие которых показано ранее в ягодах калины обыкновенной. Выявление факторов, которые определяют различия в содержании полисахаридов близкородственных видов калины, требует дальнейшего детального исследования.