Выделение жира из печени минтая с помощью нового ферментного препарата на основе штамма Aspergillus oryzae

Важнейшей отличительной особенностью жиров рыб от жиров растений и наземных животных является наличие в их составе высоконенасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот омега-3 (эйкозапентаеновая и докозагексаеновая кислоты), что обуславливает их высокую биологическую ценность.

Типичным видом сырья для получения пищевого жира является печень трески, составляющая около 10% веса рыбы и содержащая в среднем около 50% липидов [1]. Схожими характеристиками обладает печень минтая дальневосточного – популярное на Дальнем востоке России промысловое сырье с высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК).

This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License

С технологической точки зрения сложность извлечения этих биологически ценных компонентов обусловлена высокой чувствительностью липидов рыбьего жира к окислению. Нагревание жиросодержащего сырья при контакте с воздухом приводит к запуску механизма образования перекисных соединений, имеющих высокую токсичность. Поэтому получение жира при щадящих температурных режимах является актуальной задачей для пищевой отрасли, решить которую возможно, используя ферментативный гидролиз.

Для извлечения жира из рыбного сырья энзиматическим способом в основном используют доступные коммерческие ферментные препараты экзо- и эндопептидаз, полученные на основе различных продуцентов [2–4]. В сравнительных исследованиях было отмечено, что многокомпонентные грибные протеазы могут быть эффективнее прочих препаратов [5, 6].

Результаты этих исследований показывают перспективность применения комплекса грибных протеаз для ферментолиза рыбного сырья с целью выделения жира. Во ВНИИПБТ на основе штамма Aspergillus oryzae с увеличенной активностью лейцинаминопептидазы был получен комплексный препарат протеолитического действия «Проторизин LAP». Основными компонентами ферментного комплекса продуцента являются кислая и щелочная протеазы, лейцинаминопептидаза, α-амилаза и ксиланаза [7].

Цель работы – установление оптимальных параметров ферментолиза печени минтая дальневосточного, обеспечивающих высокий уровень извлечения жира без негативного влияния на его качество.

Материалы и методы

Объектами исследования являлись замороженная печень минтая дальневосточного ( Theragra chalcogramma ) и жир, полученный из печени ферментативным способом.

Отбор средних проб замороженной печени и их подготовку к физико-химическим анализам проводили в соответствии с ГОСТ 31339–2006 [8]. Физико-химические показатели устанавливали согласно ГОСТ 7636–85 [9]: массовую долю влаги – методом высушивания при температуре +100 °С; активную кислотность – потенциометрическим методом; массовую долю жира – экстракционно-весовым методом ВНИИКОП (ускоренным) по ГОСТ 8756.21–89 [10].

Для определения качества рыбьего жира определяли кислотное число по ГОСТ 7636–85.

Для обоснования целесообразности использования лабораторного ферментного препарата Проторизин LAP был проведен сравнительный ферментолиз при оптимальном диапазоне температур и рН для каждого из 3 коммерческих ферментных препаратов: Alcalase® 2,5 L (Novozymes, Дания); Neutrase 0,8 L (Novozymes, Дания); АцидоЛюкс-А (Сиб-биофарм, Россия)

При проведении эксперимента в заранее измельченное до однородной консистенции сырье вносили воду в соотношении 1 : 1. Ферменты добавляли в количестве 0,2% к массе сырья, предварительно устанавливали оптимальное значение рН для каждого препарата (6,7 для образцов с Alcalase и Проторизин LAP; 5,05 для АцидоЛюкс-А, без изменения для Neutrase и контрольного образца). Контрольный образец выдерживался в тех же условиях для оценки действия нативных протеолитических ферментов печени. После ферментолиза в течение 2 часов полученные ферментолизаты нагревались до температуры 90 °С для инактивации ферментов и направлялись на центрифугирование (15 мин, 3000g). Выход жира, жидкой и твердой фракции гидролизата определялись методом взвешивания. Опыты проводились с двухкратной повторностью.

Для моделирования ферментолиза на основании предварительных экспериментов и анализа литературных данных были выделены два основных фактора, определяющие выход жира и его качество: массовая доля ферментного препарата (% к массе сырья) и продолжительность гидролиза (ч).

Для определения оптимальной дозировки ФП и продолжительности было использовано математическое моделирование на основе полнофакторного эксперимента. Дозировку (ω, %) варьировали от 0,1 до 0,3% к массе обрабатываемого сырья; продолжительность процесса (T, ч) – от 0,5 до 1,5 ч при температуре 40–45 °С. В качестве показателей эффективности фер-ментолиза выбраны выход жира (ωж) и КЧ, обобщенные в единый параметр оптимизации (y) при 100% выходе и КЧ = 3,85 в качестве «идеалов» [11–20].

V /У о -ул^{2 у} = Ihd l = 1

План эксперимента представлен в таблице 1.

Таблица 1.

Матрица и план эксперимента при моделировании процесса

Table 1.

Matrix and experiment design for process modeling

Опыт Experiment	План эксперимента | Experiment design
	Массовая доля ФП | Enzyme mass fraction		Продолжительность | Duration
	по матрице, а 1 matrix, а 1	натурально, ω, % naturally, ω, %	по матрице, а 2 matrix, а 2	натурально, T, ч naturally, T, h
1	1	0,3	1	1,5
2	-1	0,1	1	1,5
3	1	0,3	-1	0,5
4	-1	0,1	-1	0,5

Связь кодированных и физических переменных определяется по формуле:

/ Xn- х0\

Xi = ( Дх )

где X i и х_п - соответственно кодированное и натуральное значения; х₀ - значение фактора на нулевом уровне; Дх - значение интервала варьирования фактора.

Реализация опытов по матрице полнофакторного эксперимента позволяет получить линейную модель вида:

у = а₀ + 0 1 x 1 + a₂x₂ + 0 1 x 1 a₂x₂

где у - обобщенный параметр оптимизации; а₀, а 1 , а₂ - неизвестные коэффициенты линейной модели; х 1 , х₂ - изменяемые факторы процесса.

Проверку адекватности полученной в кодированном виде модели проводилась по тесту Фишера (F-критерий) при 95% доверительном интервале.

Математическое моделирование для определения оптимальных значений факторов процесса проводилось в программном пакете Excel.

Результаты и обсуждения

Результаты сравнительного ферментолиза печени минтая с применением разных ферментных препаратов представлены в таблиц е 2 и на рисунке 1 .

Таблица 2.

Результаты ферментолиза с разными ферментными препаратами

Table 2.

Results of fermentolysis with different enzyme preparations

ФП Enzyme	темп., °С temp., °С	ω жидкой фракции, % ω liquid fracrion, %	ω твердой фракции, % ω solid fraction, %	ω жира, % ω oil, %	КЧ AV
Alcalase	45	50,1	32,1	17,8	4,09
	60	46,5	33,7	19,8	4,25
Проторизин LAP Protozine LAP	45	47,8	29	23,2	4,35
	60	50,6	31,2	18,2	4,68
Neutrase	45	50,2	41,1	8,7	3,87
АцидоЛюкс-А AcidoLux-A	45	45,4	42	12,6	5,03
Контроль	45	49,7	44,7	5,6	3,91

Рисунок 1. Точечная диаграмма по результатам ферментолиза с разными ФП (x – выход жира, y – кислотное число)

Figure 1. Scatter plot of enzymatic hydrolysis results with different enzymes (x – fat yield, y – acid number)

Исследуемый лабораторный ферментный комплекс показал самый высокий выход жира по сравнению с остальными ферментолизатами (23,2% при содержании жира в исходном сырье 47,64%). Как и ожидалось, наибольший выход жира при использовании коммерческих ФП показал вариант с Alcalase (19,8%). Разница между массовой долей жира, выделенного из ферментолизата с Проторизином LAP и Alcalase статистически значима (t = 5,94; p <0,05).

По кислотному числу жир, выделенный с помощью Проторизина LAP, незначительно уступает образцам с Alcalase.

Таким образом, данный ферментный препарат целесообразно использовать при ферментировании печени минтая дальневосточного, но необходимо установить оптимальные условия проведения процесса для более эффективного использования сырья.

Таблица 3.

План эксперимента и результаты его реализации

Table 3.

Experiment design and the results

Опыт Experiment	План эксперимента| experiment design			Частные отклики			Параметр оптимизации Optimization parameter
	Массовая доля ФП Enzyme mass fraction		Продолжительность Duration	Responses
	по матрице, а 1 matrix, а 1	натурально, ω, % naturally, ω, %	по матрице, а 2 matrix, а 2	натурально, T, ч naturally, T, h	ω ж (ср) ω оil (mean)	КЧ(ср) AV(mean)	y(ср) y(mean)
1	1	0,3	1	1,5	66,77	5,10	0,2226
2	-1	0,1	1	1,5	39,22	4,95	0,4579
3	1	0,3	-1	0,5	51,23	4,68	0,2914
4	-1	0,1	-1	0,5	25,19	4,61	0,6057

В таблице 3 представлен план и результаты полнофакторного эксперимента с различными концентрациями ферментного препарата Aspergillus oryzae и продолжительностью ферментолиза.

По итогам выполнения эксперимента были рассчитаны коэффициенты модели процесса ферментолиза в кодированном виде (1) и в физических единицах измерения (2).

у = 0,3944-0,1374x1-0,0541x2 (1)

у = 0,774-1,374<у-0,1082Т (2)

Проверка адекватности полученной математической модели показала, что расчетный критерий Фишера (F. = 2,77) меньше его табличного значения (F = 7,71). Следовательно, модель адекватна, то есть применима для анализа и оптимизации процесса.

Рисунок 2. Геометрическая интерпретация модели

Figure 2. Surface response of the model

Расчетные оптимальные значения дозировки

ФП и времени ферментолиза составили 0,4% и 1 ч соответственно. Апробация расчётных параметров ферментолиза показала высокий выход жира (65,42% от его содержания в сырье) при достаточно небольшом изменении кислотного числа (4,11 мг КОН / г при 3,85 мг КОН/г в исходном сырье).

Заключение

Исследование сравнительного ферменто-лиза печени минтая показало, что применение ферментного препарата «Проторизин LAP» в технологическом процессе переработки жиросодержащего рыбного. Лабораторный образец не уступает коммерческим аналогам по способности выделения жира из печени минтая и может быть перспективен в переработке другого сырья животного происхождения.

Наиболее важные факторы, влияющие на выход и качество жира печени минтая при ферментолизе – температура, дозировка ферментного препарата и продолжительность процесса. На основании полнофакторного эксперимента предложена модель, адекватно описывающая процесс ферментолиза печени минтая. Данная модель позволила рассчитать оптимальные параметры процесса ферментолиза: температура – 40…45 °С, массовая доля ферментного препарата – 0,4% и продолжительность – 1 час.

Научно-исследовательская работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы Фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2022–2024 годы (тема № № 0410–2022–0006)