Выявление возбудителей аспергиллеза и аскосфероза пчел в ряде регионов России

Другой микозной болезнью пчёл является аскосфероз, вызывающий снижение продуктивности пчелиных семей и их гибель от 10 до 45%, нанося таким образом огромный ущерб пчеловодству [1]. Аскосфероз, или известковый расплод, или меловой расплод, является инфекционной болезнью медоносных пчел и расплода [6]. Возбудитель часто поражает трутневые и пчелиные личинки 3-4 дневного возраста, которые мумифицируются и погибают. Возбудитель представляет собой грибы рода Ascosphaera, вида A. apis. [1]. В настоящее время аскосфероз широко распространён во всем мире и встречается на всех континентах. Среди факторов, способствующих распространению этого заболевания, можно перечислить кочевки, купля-продажа маток, пакетов и пчелосемей, и т.д. Быстрому развитию возбудителя также способствуют такие антропогенные факторы, как необоснованное применение различных антибиотиков, что приводит к нарушению обмена веществ в организме пчел и резкому снижению их резистентности. Для развития возбудителя, который может находиться в почве на пасеках, в пыльце собранной пчелами с нектаром, необходимы высокая температура и влажность, при этих условиях если возбудитель попадает в ослабленные пчелосемьи, то он быстро развивается.

Цель работы заключалась в следующем: выявить основных возбудителей микозов пчел на основе данных обследования образцов почв, пчел и продуктов пчеловодства, отобранных на территориях 10 районов Республики Татарстан и 6 других субъектов РФ.

Материалы и методы. Исследуемые пробы меда и образцы пчел отбирали из разных пасек на территории ряда регионов Российской Федерации (Ульяновская, Самарская, Саратовская, Волгоградская, Ростовская области, Краснодарский край); Республики Татарстан (РТ), включая следующие районы: Новошешминский, Высокогорский, Арский, Балтасинский, Черемшанский, Лаишевский, Альметьевский, Чистопольский, Нижнекамский, Заинский. Отбор проб пчел проводили в соответствии с ГОСТ 2072875. Число отобранных образцов приведено в таблицах 1 и 2.

Таблица 1 - Регионы отбора образцов пчел и меда на территории РФ

№	Регионы	Количество образцов пчел	Количество образцов меда
1	Республика Татарстан	102	51
2	Ульяновская область	66	3
3	Самарская область	51	6
4	Саратовская область	45	10
5	Волгоградская область	36	2
6	Ростовская область	89	9
7	Краснодарский край	92	5
8	Всего	481	86

Таблица 2 - Районы отбора образцов пчел и меда по РТ

№	Районы	Количество образцов пчел	Количество образцов меда
1	Новошешминский	9	6
2	Высокогорский	14	5
3	Арский	5	9
4	Балтасинский	6	3
5	Черемшанский	16	6
6	Лаишевский	7	8
7	Альметьевский	9	2
8	Чистопольский	12	4
9	Нижнекамский	14	5
10	Заинский	10	3
11	Всего	102	51

Из образцов пчёл выделяли чистую культуру гриба. Образцы пчел измельчали на маленькие кусочки размером не более 1 мм, после чего их сеяли на питательные среды и оставляли в термостаты при температуре 30°С на определенный срок. В качестве приборов использовали чашки

Петри, микологические пинцеты, ножи, ножницы и термостаты. Время экспозиции -2 недели (14 суток), в течение которого наблюдали за ростом гриба, появлением мицелиев, цист, спор и споровых шаров. В ходе наблюдения, отмечали цвет колоний, их диаметр, срок появления спороцист, спор и споровых шаров.

Для проведения ПЦР использовали набор реагентов, который включает следующие компоненты: комплект для выделения ДНК из исследуемого материала, комплект для ПЦР-амплификации ДНК в режиме реального времени и комплект контрольных образцов. Постановку реакции ставили согласно разработанной методике [5, 8] с использованием сконструированных праймеров [4].

Результаты. Исследование на наличие аспергиллов в почве методом ПЦР показало, что эти грибы отсутствуют в пробах, взятых из Альметьевского, Чистопольского, Высокогорского, Арского, Балтасинского, Нижнекамского и Лаишевского районов (таблица 3). В образцах почв Новошешминского района выявили A.niger, а Черемшанского района – A.fumigatus, A.flavus и A.niger. В пробах Заинского – A.flavus и A.niger. Возбудители аскосфероза в почвах не обнаружены.

Таблица 3 - Результаты исследования образцов пчел и меда на аспергиллез и аскосфероз на территории РТ

Дата отбора проб	Районы отбора проб	Результаты ПЦР по аспергиллам		Результаты ПЦР по аскосферам
		пчелы	мед	пчелы	мед
11.04.12	Новошешминский	-	-	-	+
14.04.12	Альметьевский	-	-	-	-
15.04.12	Черемшанский	-	+	-	-
17.04.12	Чистопольский	-	-	-	-
20.04.12	Заинский	-	+	-	-
22.04.12	Высокогорский	-	-	-	+
22.04.12	Арский	-	-	-	-
25.04.12	Балтасинский	-	-	+	+
27.04.12	Нижнекамский	-	-	+	-
30.04.12	Лаишевский	-	-	-	-

ПЦР анализ образцов меда и пчел, взятых из разных районов РТ, показал, что обследуемые пасеки Альметьевского, Чистопольского, Арского и Лаишевского районов являются благополучными по аспергиллезу и аскосферозу пчел. В тоже время исследуемые пасеки Черемшанского и Заинского районов являются неблагополучными по аспергиллезу, но благополучными по аскосферозу. Исследуемые пасеки Новошешминского, Высокогорского, Балтасинского и Нижнекамского районов являются неблагополучными по аскосферозу, но благополучными по аспергиллезу.

Исследование методом ПЦР разных регионов РФ показало, что исследуемые пасеки Самарской и Волгоградской областей являются благополучным по аспергиллезу и аскосферозу пчел (таблица 4). Исследуемые пасеки Ульяновской и Саратовской областей являются неблагополучными по аспергиллезу пчел, но благополучными по аскосферозу пчел; а Ростовской области и Краснодарского края – неблагополучными по аспергиллезу и аскосферозу.

Таблица 4 - Результаты исследования образцов пчел и мед на аспергиллез и аскосфероз на территории РФ

Дата отбора проб	Регионы отбора проб	Результат ПЦР по аспергиллам		Результат ПЦР по аскосферам
		пчелы	мед	пчелы	мед
11.06.13	Ульяновская область	+	+	-	-
11.06.13	Самарская область	-	-	-	-
12.06.13	Саратовская область	+	-	-	-
12.06.13	Волгоградская область	-	-	-	-
12.06.13	Ростовская область	-	+	+	+
13.06.13	Краснодарский край	+	-	+	-

Заключение. Таким образом основе результатов обследований образцов пчел и продуктов пчеловодства, отобранных на разных территориях регионов РФ, выявлены основные возбудители микозов пчел: A.fumigatus персистирует в Ульяновской, Саратовской и Ростовской областях и Краснодарском крае; A.apis распространена в Ростовской области и Краснодарском крае. На территориях районов Республики Татарстан: A.fumigatus преобладает в Черемшанском и Заинском районах; A.apis – в Новошешминском, Балтасинском, Высокогорскомй и Нижнекамском районах.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Клочко Р.Т., Луганский С.Н. Болезни пчел: проблемы и решения // Пчеловодство. – 2011. – №9. – С.28–31. 2. Марфенина О.Е., Бубнова Е.Н., Семенова Т.А. и др. Грибы рода Aspergillus: распространение и условия накопления в разных природных средах (на примере европейской части России) // Микология и фитопатология. – 2014. – Т.48., вып.3. – С.139-140. 3. Мукминов М.Н., Вакилова Д.Г. Потенциальная патогенность штаммов грибов рода Аspergillus для медоносных пчел // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2010. – №1. – С.119-120. 4. Ндайишимийе Э.В., Хаммадов Н.И., Осянин К.А. и др. Биоинформационный анализ олигонуклеотидов для молекулярно-генетической индикации возбудителей аспергиллеза и аскосфероза пчел // Ветеринарный врач. – 2015. – №2. – С.3-9. 5. Хаммадов Н.И., Ндайишимийе Э.В., Осянин К.А. и др. Индикация и дифференциация грибковых патогенов родов Aspergillus и Ascosphaera в объектах окружающей среды, пчелах и продуктах пчеловодства: методические рекомендации. – Казань: ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2015. – 16с. 6. Aronstein K.A., Murray K.D. Chalkbrood disease in honey bees // J. Invertebrate pathology. – 2010. – Vol. 3. – P.S20-S29. 7. Jensen A.B., Aronstein K., Flores J.M. et al. Standard methods for fungal brood disease research // J Apic Res. 2013 Jan; 52(1): 10.3896/IBRA.1.52.1.13. 8. Mukminov M.N., Ndayishimiye E.W., Shuralev E.A. et al. Molecular test system for the express detection of honeybee aspergillosis // 3rd EAVLD Congress, Pisa (Italy), 12-15 October, 2014. Abstract book. - 2014. - P.202.

ВЫЯВЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ АСПЕРГИЛЛЕЗА И АСКОСФЕРОЗА ПЧЕЛ В РЯДЕ РЕГИОНОВ РОССИИ

Ндайишимийе Э.В.

Резюме

В работе представлены результаты выявления возбудителей микозов пчел в различных субъектах РФ с использованием полимеразно-цепной реакции. Установлено, что наиболее распространенными являются A.fumigatus и A.apis .

DETECTION OF ASPERGILLOSIS AND ASCOSPHEROSIS BIOPATHOGENS OF HONEY-BEES IN SOME REGIONS OF RUSSIA

Ndayishimiye E.W.