Выживание не стволовых клеток стромы костного мозга при формировании кроветворной территории in vivo у мышей

Материалы и методы. ДККМ (n = 10) из КМ бедра мыши F1(СВА х C57Bl/6) трансдуцировали самоинактивирующим-ся лентивирусным вектором системы LeGO на основе HIV-1. Случайные сайты интеграции (СИ) провирусов являются уникальными для клетки генетически наследуемыми маркерами. Трансдуцированные стромальные подслои ДККМ имплантировали под капсулу почки сингенным реципиентам. Из фрагментов ОЭК, полученных спустя 42 дня, сажали КОЕф, оценивали эффективность маркирования исходных ДККМ и КОЕф с помощью ПЦР. Из ДНК ОЭК таргетно, с использованием ПЦР, готовили библиотеки для секвенирования СИ на Illumina MiSeq (NGS). Биоинформатической анализ проводили с помощью оригинального алгоритма на языке Python, картирование СИ было выполнено с применением инструмента NCBI BLAST.

Результаты. Среднее количество провирусов на клетку в ДККМ составило 1,6 ± 0,2. Однако ни одна из 309 КОЕф из 10 ОЭК не была маркирована согласно данным цифровой ПЦР. Это подтверждается NGS-анализом, который показал, что наиболее крупных маркированных клонов, соответствующих 40-100 клеткам, было 10 из 2165 во всех исследованных образцах. Это означает, что активно делящиеся клетки, а значит и их предшественники, не были эффективно заражены. Кроме того, ретроспективный анализ показал схожую картину эффективной трансдукции стромального подслоя ДККМ и КОЕф из него, но низкую долю зараженных КОЕф, следовательно, и МСК в ОЭК, сформированных из таких ДККМ. Таким образом, применение лентивирусных векторов системы LeGO является неэффективным для маркирования МСК. Регистрируемые маркированные клетки соответствуют не стволовым стромальным клеткам, которые переживают процедуру имплантации. Доля таких клеток от всех стромальных клеток ОЭК оценивается в среднем как 30% (диапазон значений 5% - 72%). Картирование прочтений NGS показало, что СИ распределены по всему геному мыши, с небольшими преференциями к областям генов. Задача анализа индивидуально меченных клеточных клонов на уровне отдельных клеток подразумевает строгий контроль маркирования индивидуальных молекул, поступающих в анализ, и их кластеризации. Это осложняется наличием стадий ПЦР в самой платформе Illumina и при пробоподготовке. Так анализ данных показал значительное содержание ошибок копирования и химерных прочтений (index hopping), возникновение которых неизбежно при ПЦР. Их наличие заметно запутывает данные, а их эффективное отсеивание требует предусмотрения их идентификации и введения соответствующих меток в библиотеку на стадии дизайна эксперимента. В процессе работы разработана оригинальная методика (пайплайн) для анализа СИ и сформулированы ключевые замечания по улучшению протоколов исследований индивидуально маркированных клеток. Использование цифровой ПЦР при анализе эффективности маркирования имеет значительное преимущество над ПЦР в реальном времени и тем более традиционной гнездовой ПЦР, а в случае применения последних необходимо учитывать возможность поднятия сигнала с индивидуальных молекул.

Выводы . Результаты показывают, что при формировании кроветворной территории de novo в месте имплантации КМ выживают не стволовые клетки трансплантируемой стромы, которые составляют порядка 30% стромы ОЭК. Эффективность заражения МСК в составе подслоя ДККМ заметно ниже, чем эффективность заражения КОЕф и более дифференцированных стромальных клеток. Это может быть обусловлено совокупностью молекулярных процессов, которые определяют стволовый статус клетки. Целесообразен дальнейший поиск стратегий эффективного индивидуального маркирования МСК. NGS анализ интеграций лентивекторов третьего поколения системы LeGO не выявил наличия горячих точек интеграции в геноме.

Часть работы по биоинформатическому анализу поддержана грантом РНФ № 22-25-00459