Вызревание растений для создания коллекции винограда in vitro

Введение. На современном этапе развития общества сохранение биоразнообразия растений является глобальной проблемой, так как изменение климата, экологические катастрофы, войны и антропогенное воздействие приводят к уничтожению растительного генофонда и наносят невосполнимый урон биологическому разнообразию Земли.

Микроклональное размножение широко используется в разных странах для создания высококачественного посадочного материала различных сельскохозяйственных культур, тем самым эффективно способствуя развитию сельского хозяйства в настоящее время и в обозримом будущем. Благодаря применению данного метода, появилась возможность создания банков in vitro редких и ценных генотипов растений [1-3].

При хранении коллекций in vitro в оптимальных условиях (t = 20–25 °С) возникает необходимость частого переноса растений на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения образца и увеличивает риск его инфицирования. Кроме того, частое пассирование микропобегов стимулирует активное деление клеток, что может приводить к возникновению сомаклональных вариантов.

Хранение в условиях минимального роста -один из самых эффективных способов содержания коллекций [4-6]. Главный методический подход к депонированию растений in vitro - достижение состояния максимально замедленного метаболизма, способного поддерживать жизнеспособность растительных тканей.

Замедление роста обычно достигается за счет модификации сред [7] или условий культивирования. Наиболее часто для сохранения растений в коллекции применяют пониженные положительные температуры [8], снижение интенсивности освещения, уплотняют питательную среду путем повышения в ней содержания агара [9]. Для торможения роста растений помимо этого в питательную среду добавляют осмотики сорбит [10], манит, ретарданты (например хлор-холинхлорид), гормоны (регуляторы роста) и др. [11]. Следует отметить, что во всех рассмотренных способах продолжительность беспересадочного хранения увеличивается практически вдвое и составляет около 12 месяцев. Однако биологические особенности растений позволяют более продолжительное беспересадочное хранение растений - до 2-3 лет [12].

Известна возможность получения растений in vitro с вызревшей лозой [13]. Авторы отмечают, что теоретически растения с вызревшей лозой in vitro (микросаженцы) можно в течение нескольких лет хранить плотно упакованными в ящиках без освещения при температуре 1-7 °С, перевозить на большие расстояния и создавать коллекцию сортов. Однако это не подтверждено фактическими данными.

Цель исследования – разработка способа создания коллекции генофонда винограда in vitro при совместном применении биотехнологических методов: модификации питательной среды и культивировании растений в условиях пониженной положительной температуры.

Задачи: разработка длительного (до 2-3 лет) депонирования растений винограда in vitro с вызревшей лозой, позволяющего за счет увеличения продолжительности беспересадочного хранения, сокращения трудозатрат и исключения дорогостоящих реактивов повысить экономическую эффективность хранения генофонда винограда in vitro и обеспечить сохранность генетической стабильности образцов.

Материалы и методы . Исследование проводили по общепризнанным в биотехнологии методикам на классических, донских аборигенных, подвойных сортах и сортах винограда селекции института в стационарных лабораторных условиях в период 2014-2021 гг.

Для опытов отбирали растения, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1– 0,2 мм и размноженные в культуре in vitro . В операционной комнате в ламинарном боксе «Фортран» осуществляли микрочеренкование растений. Длина микрочеренка: 10–12 мм, 1-2 мм над глазком, остальная под глазком.

Полученные микрочеренки высаживали по одному в пробирку на твердую питательную

Таблица 1

Показатели вызревания in vitro растений сорта Баклановский при различном содержании сахарозы в составе питательной среды (2014 г.)

среду Мурасиге и Скуга следующего состава мг/л: макроэлементы: NH 4 NO 3 – 138, KNO 3 – 950, MgSO 4 · 7H 2 O (MgSO 4 · 5H 2 O) – 185, KH 2 PO 4 – 68, CaCl 2 · 2H 2 O – 166; микроэлементы: H 3 BO 3 – 6,2, MnSO 4 · 4H 2 O (MnSO 4 · 5H 2 O) -22,3, СuSO 4 · 5H 2 O - 0,025, CoCl 2 · 6H 2 O -0,025, ZnSO 4 · 7 H 2 O - 8,6, Na 2 MoO 4 - 0,25, KJ -0,83; хелат железа: железо сернокислое 7-вод-ное (FeSO 4 · 7Н 2 O) – 27,8, трилон-Б-Na 2 ЭДТА – 37,3; витамины: мезоинозит – 50, тиамин HCl – 0,2; ИУК – 0,1–3 мг/л; рН среды перед автоклавированием – 5,7-5,9 (рис. 1).

Культивирование осуществляли в культуральной комнате при освещенности 3,0 тыс. люкс, фотопериоде 16/8 ч, температуре 25–27 ± 2 °С, влажности воздуха 70–75 %.

Повторность опыта 3-кратная, в каждой повторности по 14 растений.

Показатели, учитываемые при регенерации и сохранении растений: приживаемость, гибель от инфекции, гибель из-за отсутствия развития, число корней, длина корней, средняя длина корня, ризогенная зона, высота растений, количество листьев всего и на 1 см побега, скорость роста, коэффициент полярности.

Жизнеспособность растений оценивали по количеству некрозов тканей листьев и побегов: 0 баллов – визуальная гибель растения; 1 балл – некроз более 50 % тканей растения; 2 балла – некроз менее 50 % тканей; 3 балла – растения без некроза.

Результаты и их обсуждение . Установлено, что в процессе культивирования происходит вызревание побегов растений в пробирках, которое зависит от содержания сахарозы в составе питательной среды. Наибольшее число растений сорта Баклановский с вызреванием побегов выявлено при концентрации сахарозы 50-60 г/л (табл. 1).

Сахароза, г/л	Продолжительность хранения, дней	Вызревших растений, шт.	Длина вызревшей части побегов, см
20,0	330	1	6,0
30,0	330	2	2,5
40,0	330	3	5,3
50,0	330	6	5,5
60,0	330	1	4,0

Рис. 1. Вызревание растений сорта Сибирьковый в процессе хранения

Вызревание лозы произошло и при культивировании растений сортов Крестовский и Си-бирьковый (табл. 2). Лучшее вызревание выявлено при концентрации сахарозы 60,0 г/л, что позволило получить 140 одноглазковых микрочеренков. Этого количества достаточно для регенерации растений, массового их тиражирования и перезакладки коллекции.

Таблица 2

Число вызревших микрочеренков при продолжительном культивировании растений в зависимости от содержания сахарозы в питательной среде (2011-2012 гг.)

Сорт	Концентрация сахарозы, г/л
	10	20	30	40	50	60	Всего
Крестовский	–	–	9	–	4	73	86
Сибирьковый	–	–	13	6	16	67	102
По двум сортам	–	–	22	6	20	140	188

В процессе продолжительного беспересадочного хранения пробирочных растений на питательной среде с повышенными концентра- циями сахарозы (50-60 г/л) появлялась осенняя окраска листьев и происходило вызревание побегов у 11 различных сортов винограда (табл. 3).

Таблица 3

Сорт	Продолжительность хранения, дней	Вызревших растений, шт.	Длина вызревшей части побегов, см
Сыпун черный	300	11	3,9
Виерул	300	11	4,0
Цимлянский черный (2-3)	300	8	3,4
Кумшацкий	300	5	5,1
Цимладар	300	5	2,4
Баклановский	300	3	4,2
Каберне Совиньон	330	6	5,3
Кумшацкий	330	6	4,8
Рупестрис дю Ло	330	6	3,6
Красностоп золотовский	330	4	2,6
Сибирьковый	330	2	3,0

Показатели вызревания побегов некоторых сортов винограда при содержании сахарозы в питательной среде 60,0 г/л

Факт вызревания побегов в условиях депонирования является положительным для создания коллекции. Вызрело по 11 растений сортов Сыпун черный и Виерул, 8 растений сорта Цимлянский черный (клон 2-3), по 5-6 растений сор- тов Каберне Совиньон, Кумшацкий, Рупестрис дю Ло, Цимладар. Более слабое вызревание отмечено у растений сортов Красностоп Золо-товский, Баклановский, Сибирьковый.

Таблица 4

Показатели жизнеспособности растений различных сортов при хранении их на питательной среде с содержанием сахарозы 70,0 г/л (2013 г.)

Сорт	Сохранилось, шт/%	Высота, см	Листьев, шт.			Жизнеспособность, баллы
			зеленых	пожелтевших	сухих
Хранение в течение 159 дней
Цимлянский черный (клон 2-3)	19/67,8	9,8	5,6	2,3	2,5	1,9
Косоротовский	18/64,2	7,5	5,8	2,4	2,8	2,1
Кукановский	9/32,1	9,0	5,5	1,9	3,6	2,1
Сибирьковый	15/53,6	7,8	4,8	2,0	3,1	1,9
Рупестрис дю Ло	9/32,1	5,2	4,4	1,0	1,0	2,0
Хранение в течение 247 дней
Цимлянский черный (клон 2-3)	17/60,7	10,4	3,7	2,4	4,0	1,1
Косоротовский	17/60,7	8,6	4,1	4,9	2,9	1,1
Кукановский	9/32,1	9,7	3,0	3,0	4,0	1,1
Сибирьковый	7/25,0	8,8	5,5	3,1	5,5	1,0
Рупестрис дю Ло	7/25,0	5,7	4,0	1,9	2,5	1,1
Хранение в течение 263 дней
Косоротовский	7/25,0	–	3,7	4,6	5,0	1,0
Кукановский	7/25,0	–	2,0	4,0	6,6	1,0
Сибирьковый	7/25,0	–	3,0	2,7	7,0	1,0
Рупестрис дю Ло	4/14,2	–	3,5	2,5	2,5	1,2
Цимлянский черный (клон 2-3),	0	сухие	0	2,0	7,3	0

Пониженная положительная температура – фактор, замедляющий ростовые процессы. В связи с этим дополнительно к культивированию при повышенном содержании сахарозы осуществляли хранение вызревших пробирочных растений в фармацевтическом шкафу при пониженной положительной температуре 1-8 °С. Растения хранились в плотно закрытых пробирках с твердой питательной средой.

Вызревшие растения хранили в течение года в фармацевтическом шкафу, а затем они были расчеренкованы и высажены на свежую питательную среду. Выявлено, что микрочеренки сохранили регенерационную способность. Та- ким образом, установлена возможность регенерации in vitro растений из вызревших микрочеренков, что способствует продлению сроков беспересадочного хранения.

В фармацевтическом шкафу в течение 1 года хранили вызревшие растения сортов Памяти Кострикина, Виерул, Феркаль, Рупестис дю Ло, SO 4, в течение 2 лет – растения сортов Крестовский и Сибирьковый, в течение 3 лет – растения сортов Денисовский, Сибирьковый, Фиолетовый ранний, 4 года хранили растения сортов Бакла-новский, Виерул, Сыпун черный, Цимладар, Си-бирьковый (рис. 2). Характеристика их состояния представлена в таблице 5.

Рис. 2. Хранение растений в фармацевтическом шкафу

Таблица 5

Показатели состояния растений после хранения при температуре 8 °С в течение 3–4 лет

Сорт	Длительность хранения, лет	Растений с вызреванием, шт.	Высота растений, см	Вызревание побегов
				см	%
Межвидовые сорта
Баклановский	4	8	10,7	4,0	49,9
Виерул	4	8	10,4	7,0	67,8
Денисовский	3	3	14,6	10,3	70,3
Фиолетовый ранний	3	3	7,3	4,3	60,9
Аборигенные донские сорта винограда
Сибирьковый	3	1,0	11,0	6,0	54,5
Сыпун черный	4	11,0	9,4	5,8	64,1
Цимладар	4	6	6,9	4	68,9
Цимлянский черный (клон 2-3)	4	5	9,7	5,3	55,0
Подвойный сорт
Рупестрис дю Ло	3	6	6,3	4,3	67,7

Растения после хранения были одревесневшими с различной степенью вызревшей части. Среда в пробирках не высохла. Длина вызревшей части, как это следует из данных таблицы 5, колебалась от 49,8 до 70,3 %. Лучшее вызревание по сравнению с аборигенными отмечено у межвидовых сортов винограда. Вызревание у подвоев также было высоким. У сортов Виерул и Рупестрис дю Ло оно составило 67,8-67,8 %. Более значительное вызревание отмечено у сортов Фиолетовый ранний и Денисовский. Среди аборигенных сортов винограда по степени вызревания выделился Цимладар.

Растения сортов Баклановский, Виерул, Фиолетовый ранний, Денисовский, Сыпун черный, Цимладар и Цимлянский черный были расчеренкованы. Одревесневшие микрочеренки с живыми тканями были высажены на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга.

Учет, проведенный через месяц, показал, что произошла единичная регенерация побегов у

Таблица 6

Показатели регенерации растений в стандартных условиях культивирования (30 дней) после 3-4 лет хранения при температуре 1-8 °С

Сорт	Продолжительность хранения, лет	Растения		Корень
		Число, шт.	Длина побега, см	Число, шт.	Длина, см
Баклановский	4	2	2,5	1	2,3
			0,5	1	0,5
Фиолетовый ранний	3	1	0,3	–	–
Сыпун черный	4	1	1,0	1	0,8
Цимладар	4	1	–	4

Дальнейшее культивирование этих восстановленных растений в стандартных условиях культуральной комнаты при освещенности 2,0– 3,0 тыс. люксов, фотопериоде 16 ч, температуре 25–27 ± 2 °С, влажности воздуха 70–75 % на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга с сортов Баклановский, Сыпун черный. Кроме этого, отмечено образование побега без корней у сорта Фиолетовый ранний, корней (4 шт.) у сорта Цимладар. У остальных одревесневших микрочеренков развитие отсутствовало. Состояние регенерации растений представлено в таблице 6.

добавлением регулятора роста «Мелафен» в концентрации 10–7 способствовало дальнейшей регенерации и улучшению ростовых процессов как корней, так и побегов, что показано в таблице 7. Происходило полное восстановление растений.

Таблица 7

Показатели ростовых процессов восстановленных растений при культивировании в течение 3 месяцев

Сорт	Корни			Высота, см	Число листьев всего, шт.	Коэффициент полярности
	Число, шт.	Длина, см	Ризогенная зона, см
Фиолетовый ранний	2,1	0,7	1,7	1,5	2,0	0,7
Баклановский	3,0	2,4	7,2	4,5	4,2	1,6
Сыпун черный	4,6	1,6	7,3	4,6	5,1	1,5
Цимладар	4,0	0,9	3,6	1,7	2,0	2,1

На основании полученных данных впервые доказана возможность беспересадочного хранения пробирочных растений винограда при температуре 1-8 °С в течение 3-4 лет.

Заключение

• 1.    В процессе продолжительного беспересадочного культивирования растений на питательной среде с повышенными концентрациями сахарозы появлялось осенняя окраска листьев и происходило вызревание побегов. Наибольшее число растений с вызреванием побегов обнаружено при концентрации сахарозы 50-70 г/л.

• 2.    Степень вызревания in vitro зависит от сортовых особенностей растений: высокая у сортов Сыпун черный, Виерул, Цимлянский черный (клон 2-3); средняя у сортов Каберне Совиньон, Кумшацкий, Рупестрис дю Ло, Цим-ладар; слабая у растений сортов Красностоп Золотовский, Баклановский, Сибирьковый.

• 3.    Для дальнейшего замедления ростовых процессов и сохранения уже вызревших растений необходимо осуществлять культивирование их при пониженной положительной температуре.

• 4.    Выявлено, что в результате хранения при температуре 1-8 °С в течение 3–4 лет растения имели длину вызревшей части побегов

• 5.    Учет, проведенный через месяц культивирования, показал, что при высадке одревесневших микрочеренков с живыми тканями на твердую питательную среду Мурасиге-Скуга произошли единичная регенерация побегов и восстановление растений.

• 6.    Культивирование этих восстановленных растений в стандартных условиях культуральной комнаты на твердой питательной среде Му-расиге-Скуга с добавлением регулятора роста «Мелафен» в концентрации 10^–7 способствовало дальнейшей регенерации и улучшению ростовых процессов как корней, так и побегов. Произошло полное восстановление растений.

• 7.    На основании полученных данных впервые доказана возможность беспересадочного хранения пробирочных растений винограда в течение 3-4 лет при сочетании двух факторов: повышенной концентрации сахарозы в составе питательной среды и пониженной положительной температуры 1-8 °С.

49,8-70,3 %. Лучшее вызревание по сравнению с аборигенными отмечено у межвидовых сортов винограда и подвоев.