Взаимосвязь адсорбционных свойств фуросемида и йод-фуросемида с их диуретической и салуретической активностью

Широкое применение в клинической практике мочегонных средств обусловливает необходимость постоянного поиска новых диуретиков, обладающих большей активностью, селективностью, а также меньшим количеством побочных эффектов. Это связано с отсутствием мочегонных препаратов, высокая диуретическая активность которых сочеталась бы с отсутствием осложнений при применении этой группы лекарственных средств

[1–3]. В процессе поиска более активных и селективных современных мочегонных препаратов нами было получено новое соединение – 4-хлоро-2-[(5-иодофуран)ме-тиламино]-5-сулфанилбензойная кислота (йод-фуросе-мид). Соединение получено путем замещения атома водорода во втором положении фуранового цикла йодом в молекуле фуросемида. Атом йода имеет больший размер, способный увеличить площадь гидрофобного сегмента фуранового цикла, что может увеличить прочность комплекса и повысить активность нового соединения.

Цель работы: выявить и объяснить связь изменения биологической активности йод-фуросемида с изменениями его физико-химических свойств, обусловленными особенностями пространственной и электронной структуры.

Материал и методы

Квантово-химические расчеты структур молекул проводились с применением метода функционала плотности DFT B3LYP с использованием базиса 6-31G** (d, p). Для оптимизированной геометрии был проведен расчет инфракрасного спектра; отсутствие отрицательных частот доказывает стабильность найденных структур. Расчет выполнен с помощью программного комплекса PCGAMESS (Firefly), версия 7.1.С., разработанного группой под руководством проф. А.А. Грановского в лаборатории химической кибернетики МГУ [5, 6].

Для оценки гидрофобности молекул были изучены адсорбционные свойства этих веществ на активированном угле. Измерения концентрации фуросемида и йод-фуросемида были выполнены фото-колориметрическим методом при длине волны 315 нм, что близко к максимуму поглощения при 320 нм в УФ спектре фуросемида и йод-фуросемида на КФК-2. Предварительно были получены калибровочные кривые для растворов с известной концентрацией. Измерение адсорбции проводили для растворов с различной концентрацией веществ и фиксированным содержанием адсорбента.

Исследование диуретической активности проведено в осенний период на крысах-самцах Wistar массой 220– 250 г, которых содержали на стандартной диете при свободном доступе к воде в естественном световом режиме. Животные находились в индивидуальных клетках, приспособленных для сбора мочи. Подопытные крысы были разделены на две группы. После определения контрольных показателей функции почек всем животным I группы (n=12) однократно было введено подкожно 15 мкМоль/кг фуросемида в 1 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия. Крысам II группы (n=12) – 15 мкМоль/кг йод-фуросемида. Собирали мочу за сутки, определяя величину диуреза, экскрецию с мочой ионов натрия, калия и хлора. Сравнивали показатели у животных обеих групп, а также с цифрами, полученными после подкожного введения 1 мл физиологического раствора. Ионы натрия и калия определяли методом пламенной фотометрии на фотометре ПАЖ-3. Исследования на животных проводили в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ МЗ СССР № 75 от 12.08.1987 г.) и Федеральным законом РФ “О защите животных от жестокого обращения” от 01.01.1997 г. Статистическую обработку производили методом вариационных рядов с использованием критериев Стьюдента. Анализ данных выполнен с использованием программы Biostat для Windows.

Результаты

Сравнение диуретической и салуретической активности исследуемых веществ. Однократное подкожное введение фуросемида увеличивало суточный диурез с 6,3±1,0 до 20,2±1,5 мл/сут (в 3,2 раза). Введение йод-фу-росемида увеличивало суточный диурез с 4,4±0,6 до 24,7±1,7 мл/сут (в 5,7 раза). Экскреция ионов натрия под влиянием фуросемида повысилась с 166±23,1 до 1015±60,2 мкМоль/сут (в 6,1 раза). Под влиянием йод-фуросемида этот показатель увеличился с 109±27,5 до 1271±71,4 мкМоль/сут (в 11,7 раз). Экскреция ионов калия под действием фуросемида увеличилась с 449±83,1 до 848,74±34,0 мкМоль/сут (в 1,9 раза). Под влиянием йод-

Таблица 1

Эффективные заряды на атомах по Милликену

Фуросемид			Йод-фуросемид			Фуросемид			Йод-фуросемид
атом		заряд	атом		заряд	атом		заряд	атом		заряд
1	O	–0,521	1	O	–0,519	17	C	0,346	17	C	0,340
2	O	–0,519	2	O	–0,518	18	C	-0,102	18	C	–0,046
3	H	0,298	3	H	0,299	19	N	-0,640	19	N	–0,641
4	H	0,300	4	H	0,300	20	C	0,569	0	C	0,571
5	N	–0,711	5	N	–0,711	21	O	-0,529	1	O	–0,529
6	S	1,179	6	S	1,180	22	O	-0,479	22	O	–0,476
7	O	–0,441	7	O	–0,430	23	H	0,166	23	H	0,168
8	C	0,135	8	C	0,092	24	Cl	0,044	24	Cl	0,173
9	C	–0,136	9	C	–0,102	25	H	0,116	25	H	0,117
10	C	–0,136	10	C	–0,136	26	H	0,330	26	H	0,332
11	C	0,256	11	C	0,257	27	H	0,117	27	H	0,122
12	C	–0,050	12	C	–0,051	28	H	0,104	28	H	0,113
13	C	0,027	13	C	0,032	29	H	0,103	29	H	0,140
14	C	–0,108	14	C	–0,115	30	H	0,135	30	H	0,134
15	C	–0,170	15	C	–0,132	31	H	0,131	31	H	0,302
16	C	–0,118	16	C	–0,342	32	H	0,301	32	I	0,075

Таблица 2

Структурные параметры молекул фуросемида и йод-фуросемида

Фуросемид		Йод-фуросемид
Параметр	Значение	Параметр	Значение
Двугранный угол C13-C17-C11-O7	–45,98	Двугранный угол C13-C17-C11-O7	–46,70
Двугранный угол N19-C12-C11-O7	–60,16	Двугранный угол N19-C12-C11-O7	–60,39
Двугранный угол H32-N19-C11-O7	–41,20	Двугранный угол H31-N19-C11-O7	–41,73
Двугранный угол C14-C15-S6-N5	4,04	Двугранный угол N5-S6-C15-C14	2,75
Двугранный угол C17-C13-C20-O21	0,43	Двугранный угол C17-C13-C20-O21	0,62
Водородная связь O21 – H32	1,915	Водородная связь O21 – H31	1,911
Межъядерное расстояние H32 – O7	2,613	Межъядерное расстояние H31 – O7	2,626
Межъядерное расстояние O21 – H26	0,972	Межъядерное расстояние O21 – H26	0,972
Межъядерное расстояние N19 – H32	1,010	Межъядерное расстояние N19 – H31	1,010

Таблица 3

Межъядерные расстояния

Фуросемид Йод-фуросемид Фуросемид Йод-фуросемид Атомная пара Заряд Атомная пара Заряд Атомная пара Заряд Атомная пара Заряд 1 2 2,557 1 2 2,557 13 14 1,400 13 14 1,400 3 5 1,016 3 5 1,016 13 20 1,479 13 20 1,480 6 15 1,799 6 15 1,800 14 23 1,082 14 23 1,082 7 10 2,237 7 10 2,239 16 18 1,383 16 18 1,380 8 11 2,200 8 11 2,197 17 19 1,359 17 19 1,360 9 28 1,080 9 27 1,079 20 21 1,369 20 21 1,368 11 12 1,490 11 12 1,489 21 26 0,972 21 26 0,972 12 31 1,097 12 30 1,097 2 6 1,465 2 6 1,464 13 17 1,432 13 17 1,431 5 6 1,691 5 6 1,692 14 18 2,766 14 18 2,767 7 9 2,238 7 9 2,246 15 17 2,856 15 17 2,858 8 9 1,360 8 9 1,362 17 18 1,417 17 18 1,417 9 10 1,435 9 10 1,433 19 32 1,010 19 31 1,010 10 29 1,081 10 28 1,080 21 22 2,242 21 22 2,241 12 30 1,102 12 29 1,101 1 6 1,465 1 6 1,464 13 16 2,804 13 16 2,794 4 5 1,016 4 5 1,016 14 15 1,387 14 15 1,388 7 8 1,365 7 8 1,363 15 16 1,409 15 16 1,405 7 11 1,371 7 11 1,376 16 24 1,746 16 24 1,791 8 27 1,079 8 32 2,088 18 25 1,081 18 25 1,081 10 11 1,363 10 11 1,362 20 22 1,215 20 22 1,214 12 19 1,458 12 19 1,457 21 32 1,915 21 31 1,911 фуросемида выделение калия возросло с 328±26,4 до 1081,0±54,2 мкМоль/сут (в 3,3 раза).

Таким образом, в экспериментах на крысах однократное подкожное введение йод-фуросемида вызвало в 1,8 раза более выраженный диуретический и салуретичес-кий эффект, чем введение эквимолярной дозы фуросемида.

Сравнение пространственной структуры и распределения зарядовой плотности в молекулах. Посредством квантово-химических расчетов проведена оптимизация геометрии молекул фуросемида и йод-фуросемида. Рассчитанные распределения зарядов по Милликену приведены в таблице 1.

Эффективные заряды на атомах практически не изменяются, за исключением атомов, связанных с атомом йода, или находящихся в непосредственной близости от этого заместителя. Также практически не изменилось распределение зарядов на атомах карбоксильной и сульфаниламидной группы, способных образовать водородные связи с субстратом и участвующих в специфической сольватации.

В таблице 2 представлены основные структурные параметры рассчитанных молекул.

Величины межъядерных расстояний представлены в таблице 3. Как видно из таблиц 2 и 3, основные геометрические параметры, углы между плоскостями бензольно- го кольца и фуранового цикла, а также углы между плоскостью кольца, карбоксильной и сульфаниламидной группой практически идентичны в обеих молекулах. В целом геометрия не претерпела существенных изменений, за исключением самого заместителя – атома йода, обладающего большим Ван-дер-ваальсовым радиусом.

Сравнительный анализ структур этих молекул показал, что их геометрические параметры практически одинаковы, различия в длинах связей незначительны. Распределение заряда на основных функциональных группах, участвующих в специфических взаимодействиях с белковым субстратом, также не претерпело существенных изменений. Это позволяет предположить, что основную роль в повышении биологической активности молекулы играет само наличие объемного заместителя – йода, в значительной степени увеличивающего гидрофобный эффект. По литературным данным, введение йода сопровождается увеличением ДG гидрофобного эффекта для йод-бензола в сравнении с бензолом на 3,7 кДж/моль [4]. Теоретически это приводит к увеличению константы прочности комплекса с белковыми молекулами в 4,2 раза при температуре 310 К.

Сравнение адсорбционных свойств веществ. С целью сравнения гидрофобных свойств исследуемых веществ мы изучили их адсорбцию на активированном угле. Адсорбцию проводили при различных концентрациях веществ и при фиксированном содержании адсорбента. Для полученных значений были рассчитаны и построены изотермы адсорбции (рис. 1) с учетом одинакового числа мишеней, то есть равных Г _∞ . Для этих уравнений Г _∞ =0,477 и константа адсорбции для фуросемида K_ф=0,0636, для йод-фуросемида K_йод-ф=0,0908. Суммарное среднеквадратичное отклонение для изотерм адсорбции ∆ d²=0,00011. Константа адсорбции для йод-фуросемида больше константы адсорбции фуросемида в 1,43 раза. С учетом близости электронного и пространственного строения увеличение адсорбционных свойств может быть связано с увеличением гидрофобности молекулы, то есть с увеличением поверхностной активности.

Обсуждение

Проведенное нами сравнительное исследование показало, что новое производное сульфанилбензойной кислоты – йод-фуросемид обладает более выраженным диуретическим и салуретическим действием в сравнении с фуросемидом у крыс. Поскольку атом йода не может образовать водородные связи с полярными функциональными группами катион-хлорных транспортеров в почечных канальцах, его роль в повышении активности пре-

Рис. 1. Изотермы адсорбции фуросемида и йод-фуросемида на активированном угле

парата, вероятно, заключается в увеличении площади гидрофобного сегмента молекулы. Это, в свою очередь, позволяет молекулам образовывать более прочные комплексы с белками-мишенями либо в меньшей концентрации блокировать то же число катион-хлорных транспортеров. Наряду с этим соотношение салуретического и диуретического эффектов исследуемых веществ позволяет с большой долей вероятности предполагать, что оба диуретика взаимодействуют с одним и тем же типом белков-мишеней в почечных канальцах, проявляя идентичный механизм диуретического действия, который отличается лишь количественно. Следует заметить, что аналогично йод-фуросемиду более активные петлевые диуретики буметанид и пиретанид, также блокирующие катион-хлорные транспортеры, имеют в своем строении большую, чем у фуросемида площадь гидрофобного сегмента при аналогичном наборе полярных функциональных групп и сходной пространственной геометрии молекулы.

Таким образом, более выраженное по сравнению с фуросемидом диуретическое и салуретическое действие йод-фуросемида указывает на то, что при поиске новых мочегонных средств с большей активностью, наряду с включением в структуру высокоактивных полярных групп для повышения прочности комплекса лекарство-мишень, целесообразно учитывать гидрофобный эффект неполярных сегментов молекулы.

Заключение

Созданное на основе широко известного диуретического препарата фуросемида новое вещество йод-фуро-семид в экспериментах на крысах показало более высокую диуретическую и салуретическую активность в сравнении с исходным препаратом. Характер изменения показателей функции почек исследуемых веществ позволяет предположить, что оба соединения взаимодействуют с одним и тем же типом белков-мишеней в почечных канальцах, проявляя идентичный механизм диуретическо- го действия, который отличается лишь количественно.

Проведенный теоретический анализ электронной и пространственной структуры и экспериментальные исследования адсорбции позволяют предположить, что увеличение биологической активности йод-фуросемида, по сравнению с фуросемидом, вероятно, связано с повышением поверхностной активности. Повышение поверхностной активности, в свою очередь, обусловлено увеличением гидрофобности молекулы за счет введения объемного заместителя йода в фурановый цикл исходной структуры.