Взаимосвязь метаболизма жирных кислот и перекисного окисления липидов у двух видов байкальской эндемичной водоросли Draparnaldioides

Введение. Эндемичные макроводоросли рода Draparnaldioides sp. выполняют немалую роль в растительной продукции оз. Байкал и являются основной водорослью третьего растительного пояса и захватывают глубины от 2,5 до 12–25 м [2; 4]. Род Draparnaldioides относится к отделу Chlorophita , класс Ulotrichophyceae , порядок Ulotrichales, подпорядок Chaetophorineae , семейство Chaetophoraceae , подсемейство Chaetophorideae , род Draparnaldioides (Meyer et Skabitsch ex Vishnyakov, 2020). С сентября 2020 г. род Draparnaldioides насчитывает 10 видов: D. arenaria, D. arnoldii, D. baikalensis, D. goroschankinii, D. lubrica, D. pumila, D. pilosa, D. plumose, D. simplex и D. vilosa [9]. Описание водоросли наиболее полно отображено у Л. А. Ижболдиной в книге «Атлас и определитель водорослей бентоса и перифитона озера Байкал (мейо- и макрофиты) с краткими очерками по их экологии» (2007). Талломы водоросли кустиковидные, высотой до 10–40 см, имеют главный ствол, от которого отходят крупные ветви 2-го и 3-го порядка, несущие боковые веточки, располагающиеся мутовками, реже одиночные или супротивные [4]. Водоросль имеет мощный ризоидный покров и слизистый чехол, защищающие растение от сильного волнового воздействия. Также у водоросли наблюдается сетчато-продырявленный хлоропласт, занимающий всю высоту клетки [4]. Активная вегетация водоросли приходится на весенне-осенний временной период (по данным Л. А. Ижболдиной — с июня по октябрь).

Все растительные и животные организмы оз. Байкал обитают в условиях невысоких температур, малого количества органических веществ, низкой минерализации и высокого содержания кислорода (до 14 мг/л). Макроводоросль ведет прикрепленный образ жизни, вследствие чего не может уйти от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды. Высокое содержание кислорода и прозрачность воды оз. Байкал в той или иной мере должны отражаться на процессах защиты водоросли от окислительного стресса. Индикатором окислительного стресса в талломах водорослей может служить оценка уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) в клеточных мембранах [5]. У прикрепленной формы морской красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis показана активация ПОЛ в периоды высокой освещенности (апрель, июль — сентябрь) [5]. В этот же период авторы наблюдали снижение концентрации фотосинтетических пигментов в результате фотоповреждения. В литературе отсутствуют какие-либо сведения по физиологии и биохимии макроводоросли рода Draparnaldioides sp. и ее устойчивости к неблагоприятным факторам среды. Ранее нами были обнаружены отличия между отдельными видами Draparnaldioides sp. (D. arnoldi и D. baicalensis) по содержанию фотосинтетических пигментов и жирных кислот (ЖК) суммарных липидов при культивировании макроводоросли в лабораторных условиях [1]. Разнонаправленные изменения ЖК-состава могут свидетельствовать о различиях в содержании активных форм кислорода (АФК) и/или интенсивности протекания ПОЛ [6].

Целью работы являлось изучение физиолого-биохимических параметров у макроводоросли в момент вылова и в процессе культивирования в лабораторных условиях.

В задачи данного исследования входило: 1) оценить содержание пероксида водорода и продуктов ПОЛ в талломах D. arnoldii и D. baicalensis сразу после вылова и в процессе культивирования в лабораторных условиях; 2) провести сравнительный анализ содержания продуктов ПОЛ и Н 2 О 2 с изменениями ЖК-состава у изученных видов.

Материалы и методы. Объектом исследования являются два вида — D. ar-noldii и D. baicalensis . Виды различаются между собой по форме боковых веточек и наличию/отсутствию у них рахиса. У D. arnoldii рахис в боковых веточках выражен, боковые веточки в очертаниях округлые, веерообразно разветвлены [4]. У D. baicalensis рахис в боковых веточках короткий, состоящий обычно из 1–2 клеток, от которых сразу начинаются ветви более-менее одинакового размера, обильно ветвящиеся в верхней части и имеющие округло-треугольную форму [4]. Если же сравнивать визуально, то D. arnoldii является более тонкой и изящной, не имеет массивного слизистого чехла, в то время как D. baicalensis — достаточно массивная и у нее присутствует заметный слизистый чехол, наблюдаемый при окраске препарата тушью (рис. 1).

Для работы пробы макроводоросли отбирали в конце августа — начале сентября на оз. Байкал в районе пос. Большое Голоустное по координатам от 52°01'33.6"N 105°25'06.7"E до 52°01'33.5"N 105°25'59.3"E. Температура воды в момент вылова составляла 11 ° С. Водоросль брали с уреза воды на глубинах до 0,5 м. Идентификацию проводили согласно определителю Л. А. Ижболдиной [4]. Часть талломов фиксировали сразу на месте в жидком азоте. Основную биомассу водоросли перевозили в сумках-холодильниках для постановки опыта по культивированию в лабораторных условиях. Культивировали водоросль в байкальской воде в течение 14 суток при непрерывном освещении с интенсивностью 2 500 лк в инкубаторе MIR-153 (Sanyo, Япония). На 7-е и 14-е сутки фиксировали материал (талломы) в жидком азоте для сравнения с точкой отбора.

Содержание H 2 O 2 определяли с ксиленоловым оранжевым [7]. Для этого навеску таллома водоросли (0,25 г) замораживали в жидком азоте и затем растирали в 2,5 мл 0,1%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ) на льду. Гомогенат центрифугировали 15 мин на 12 000 g при 4 ^оС. Для определения содержания пероксида водорода супернатант разводили 0,1%-ной ТХУ (1:4) и готовили смесь

а                                        б

Рис. 1. Внешний вид исследуемых макроводорослей. а — D. arnoldi ; б — D. baicalensis. Показан внешний вид без микроскопа (нижнее фото в чашках Петри), микроскопия талломов (среднее фото) и окрашенные тушью препараты (верхнее фото) Бар равен 500 μm.

супернатанта и реагента в соотношении 1:1 (по 0,5 мл каждого). Состав реагента: 0,5 мМ FeSO 4 × (NH 4 ) 2 SO 4 × 6H 2 O, 0,5%-ной (v/v) H 2 SO 4 , 200 мкМ ксиленолового

оранжевого (AppliChem, Германия) и 200 мМ сорбитола (Gerbu, Германия). Смесь инкубировали в течение 25 мин на мини-термошейкере TS-100 (BioSan, Латвия) при температуре 26 °С, затем пробы центрифугировали при 12 000 g в течение 5 мин. Определяли поглощение конечного продукта спектрофотометрически (SmartSpec Plus, Bio-Rad, США) при 560 нм. Содержание Н 2 О 2 рассчитывали по калибровочной кривой и выражали в мкМ/г сырого веса [3].

Содержание продуктов ПОЛ оценивали по накоплению в тканях продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП) [8]. Для определения содержания ТБК-РП 0,5 мл супернатанта добавляли к 1 мл 0,5%-ной (w/v) ТБК (Диаэм, Россия) в 20%-ной ТХУ. Смесь инкубировали на кипящей водяной бане 30 мин, останавливали реакцию охлаждением, помещая пробирки в лед. Образцы центрифугировали 5 мин при 12 000 g и измеряли абсорбцию при 532 и 600 нм. Содержание ТБК-РП рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции ТБК 155 мМ–1 см–1 после вычитания неспецифического поглощения при 600 нм и выражали в нМ/г сырого веса [3].

Данные представлены как среднее арифметическое с разбросом значений в виде стандартного отклонения в случае нормального распределения данных или как медианное значение с разбросом значений в виде интерквартильной широты (25; 75% процентиль) в случае распределения, отличающегося от нормального. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро — Уилка. Для доказательства значимых различий в случае нормального раcпределения данных использовали метод множественного сравнения средних Фишера или метод Тьюки, в случае распределения данных, отличающихся от нормального, использовали критерий Крас-келла — Уоллиса. Различия между данными считали статистически значимыми при p <0,05. Количество биологических повторностей было 2–3. Статистические расчеты осуществляли с помощью программного пакета SigmaPlot 12.0.

Результаты и обсуждение. Ранее было показано, что культивирование D. ar-noldii и D. baicalensis в лабораторных условиях приводило к изменению жирнокислотного состава талломов водоросли. Содержание ЖК у двух видов макроводоросли на момент вылова не различалось, но в процессе культивирования происходили разнонаправленные изменения. У D. arnoldii в процессе культивирования количество ненасыщенных ЖК увеличилось, в то время как у D. baicalensis количество ненасыщенных ЖК снизилось (рис. 2).

1 — 0 суток; 2 — 7 суток; 3 — 14 суток

Рис. 2. Изменение отношения суммы ненасыщенных ЖК к сумме насыщенных у двух видов Draparnaldioides сразу после вылова (0 суток), через 7 и 14 суток культивирования в лабораторных условиях . Представлено среднее значение и его стандартное отклонение

Снижение содержания ненасыщенных ЖК может свидетельствовать об интенсификации процессов ПОЛ. Одним из продуктов ПОЛ является малоновый диальдегид (МДА), который рассматривается в качестве маркера окислительного стресса. МДА наряду с другими «тиобарбитуро-реактивными продуктами» вступает в реакцию с тиобарбитуровой кислотой с образованием состава, который можно определить спектрофотометрически.

На рисунке 3 представлено содержание ТБК-РП в талломах анализируемых видов сразу после вылова и в течение 14 суток культивирования. Содержание МДА у двух видов макроводоросли изначально отличается и разнонаправленно изменяется в процессе культивирования (рис. 3). Содержание ТБК-РП было выше у D. baicalensis по сравнению с D. arnoldii на 39%. При этом у D. arnoldii наблюдали небольшой рост данных продуктов на 14-е сутки культивирования, однако различия в содержании были статистически незначимы (Р=0,069). У D. baicalensis происходило значимое снижение данного показателя в процессе культивирования (P = <0,001), на 7-е сутки снижение составило 30%, а на 14-е — 74% относительно точки вылова (0 суток).

1 — 0 суток; 2 — 7 суток; 3 — 14 суток

Рис. 3. Изменение количества ТБК-РП у двух видов Draparnaldioides сразу после вылова (0 суток), через 7 и 14 суток культивирования в лабораторных условиях. Одинаковыми строчными буквами обозначены статистически не различающиеся варианты внутри вида. Прописными буквами обозначены различия между видами. Представлено среднее значение и его стандартное отклонение

Полученные результаты свидетельствуют, что у обоих видов макроводоросли отсутствует активация процессов ПОЛ, а изменения в содержании ТБК-РП, по-видимому, являются следствием изменений в содержании ненасыщенных ЖК-субстратов ПОЛ.

Процесс ПОЛ запускается активными формами кислорода, поэтому проанализировали содержание одного из видов АФК — пероксида водорода в талломах макроводоросли (рис. 4). Значимых изменений в содержании Н 2 О 2 как сразу после вылова, так и в процессе культивирования отдельных видов, не обнаружили, хотя у D. baicalensis видна тенденция к снижению данного параметра на 14-е сутки культивирования.

1 — 0 суток; 2 — 7 суток; 3 — 14 суток

Рис. 4. Изменение содержания пероксида водорода у двух видов Draparnaldioides сразу после вылова (0 суток), через 7 и 14 суток культивирования в лабораторных условиях

Макроводоросли ведут прикрепленный образ жизни и как и высшие растения они не могут изменить место своего произрастания для того, чтобы покинуть неблагоприятные условия окружающей среды. Интенсивность освещения и температура среды выступают основными абиотическими факторами, определяющими географическое распространение морских макроводорослей, их выживание и продуктивность [5]. Перенос из естественной среды обитания в лабораторные условия может также выступать стрессором, и его действие на разные виды может различаться. Кроме того, безусловно на физиолого-биохимические параметры влияет сезон вылова, так как существует различие в температуре вод и их освещенности.

Одними из первых на изменение условий обитания реагируют мембранные системы клетки, от состава и соотношения липидов зависит текучесть мембран, определяющая структуру и функции мембранных белков и жизнедеятельность клетки в целом. ЖК-состав липидов и интенсивность ПОЛ — это взаимосвязанные параметры. D. arnoldii и D. baicalensis отличались между собой по содержанию ТБК-РП и по направленности изменений ТБК-РП и ЖК-состава липидов.

Заключение. Таким образом, два изученных вида Draparnaldioides проявили различную реакцию при культивировании талломов в лабораторных условиях. Эти данные предполагают, что отдельные виды, возможно, имеют и различный адаптационный потенциал. Необходимы дальнейшие исследования состояния мембран клеток и других физиолого-биохимических показателей, отражающих адаптационные способности организмов, у представителей байкальского эндемичного рода Draparnaldioides.