Взаимосвязь полиморфных вариантов гена KCNB1 на продуктивные качества и физико-химические свойства молока при применении в рационе пробиотической добавки «КЛЮВЕР ПРО»

Введение. Современные подходы к организации полноценного кормления высокопродуктивных сельскохозяйственных животных основываются на научно обоснованном балансировании рационов по основным питательным веществам, энергетическим показателям, а также по содержанию макро- и микроэлементов и витаминов. В молочном скотоводстве именно качество рациона является определяющим фактором, влияющим на общее физиологическое состояние животных, уровень молочной продуктивности, воспроизводительные функции, а также на пищевую и биологическую ценность молочного сырья [2].

С ростом удоев наблюдается сокращение срока продуктивного использования коров: в среднем он ограничивается 3,3 лактациями, при этом максимальные показатели продуктивности достигаются на 4-5 лактациях. В ряде современных молочных комплексов уровень ежегодной выбраковки высокопродуктивных животных превышает 40 %. Подобное сокращение срока хозяйственного использования снижает экономическую отдачу, так как до завершения второй лактации коровы в основном только компенсируют затраты на выращивание, и лишь после этого начинают приносить прибыль. Наиболее распространёнными причинами выбраковки (до 70 %) являются бесплодие, заболевания молочной железы и конечностей, что в значительной степени связано с особенностями кормления [2, 4].

В настоящее время поддержание высокой молочной продуктивности, как правило, достигается за счёт включения в рационы легкоусвояемых углеводных кормов. Однако их чрезмерное количество оказывает неблагоприятное воздействие на метаболизм в рубце. Согласно исследованиям, при избыточном поступлении крахмала с рационом возрастает численность амилолитических микроорганизмов, что сопровождается усиленным образованием молочной кислоты и снижением pH содержимого рубца ниже 6,0, тогда как для оптимального функционирования симбиотической микрофлоры необходим диапазон pH 6,5– 7,2 [5]. Подобная кислотная среда ингибирует активность целлюлозолитических бактерий, ответственных за расщепление клетчатки грубых кормов, что приводит к ухудшению его ферментативной деградации и снижению усвоения питательных веществ. Такие метаболические нарушения проявляются снижением оплодотворяемости, нарушением течения стельности, ослаблением лактационной функции, что напрямую отражается на объёмах молочной продукции и рентабельности молочного животноводства [3, 11].

Особо уязвимой группой являются животные с высоким генетическим потенциалом продуктивности. Их физиология ориентирована преимущественно на интенсификацию синтеза молока, даже при дефиците поступающих питательных веществ. Длительный отбор по признаку удоя сформировал у таких животных выраженную «лактационную доминанту», в рамках которой значительная часть ресурсов организма направляется на продукцию молока, что нередко происходит в ущерб другим жизненно важным системам.

Среди пробиотических дрожжей наиболее широко применяются представители Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Candida utilis и др. Наибольшее распространение получили пивные дрожжи S. cerevisiae, отличающиеся хорошо изученным геномом и высоким уровнем биологической безопасности. В пищевой промышленности и диетологии человека на протяжении длительного времени используется другой вид - Kluyveromyces marxianus. Эти дрожжи активно применяются в процессах брожения и находят широкое использование в биотехнологии, включая фармацевтическую отрасль. В молочном скотоводстве K. marxianus изучен пока недостаточно, однако представляет собой перспективный пробиотический штамм. Его уникальные свойства - высокая термоустойчивость и способность утилизировать широкий спектр субстратов - обеспечивают дополни- тельные преимущества по сравнению с традиционно применяемыми дрожжами [6, 8, 9].

Несмотря на высокую значимость кормления, основополагающим фактором в формировании продуктивных качеств крупного рогатого скота остаётся наследственность. Генетические особенности животных определяют их потребность в питательных веществах и уровень реализации продуктивного потенциала. В странах с развитым молочным скотоводством отмечается устойчивая тенденция к повышению удоев за счёт применения методов молекулярногенетической селекции в сочетании с рационально сбалансированным кормлением [13].

Синтез компонентов молока регулируется, в том числе, трансмембранным активным транспортом веществ и активностью ионных каналов, и синтезируются либо в эпителиальных клетках молочной железы, либо поступают туда из крови, проходя через апикальную мембрану. Для большинства таких компонентов требуются специализированные транспортные белки – активные или пассивные [10].

Зачастую ассоциированы с признаками молочной продуктивности локусы генов, кодирующих такие трансмембранные белки. Калиевые каналы, кодируемые семейством генов KCN и играющие важную роль в поддержании мембранного потенциала и межклеточной сигнализации, представляют в этом процессе особый интерес. В частности, ген KCNB1 , относящийся к подсемейству потенциалзависимых калиевых каналов, вовлечён в процессы апоптоза, клеточной пролиферации и регенерации тканей молочной железы. Вместе с тем установлено, что KCNB1 оказывает влияние на устойчивость к маститу благодаря регуляции процессов клеточного деления, апоптоза и восстановления эпителиальной ткани вымени. Ген локализован на 13-й хромосоме крупного рогатого скота (BTA-13), имеет длину около 110,35 кб, включает два экзона и один интрон, и кодирует белок из 858 аминокислотных остатков. В интронной области данного гена был идентифицирован однонуклеотидный полиморфизм (g.78216220G>A). Ген KCNB1 рекомендован в качестве маркерного гена, ассоциированного с продуктивными признаками молочного скота [12].

Целью исследования было изучить ассоциацию полиморфизма гена KCNB1 на молочную продуктивность и физико-химические свойства молока коров голштинской породы при скармливании пробиотической добавки «КЛЮВЕР ПРО» (г. Москва, Россия) на основе штамма дрожжей Kluyveromyces marxianus.

Материалы, методы и условия проведения исследования .

Объектами исследования являлись 120 клинически здоровых коров голштинской породы 2–4-й лактации на привязном содержании на базе СХПК племенной завод им. Ленина Атнинского района Республики Татарстан. По принципу групп-аналогов животных разделили на две группы по 60 голов. Контрольная и опытная группы получали одинаковый общехозяйственный рацион, соответствующий нормам кормления дойных коров. Дополнительно в рацион животных опытной группы вводили пробиотическую кор- мовую добавку «КЛЮВЕР ПРО» на основе дрожжей Kluyveromyces marxianus в дозировке 20 г на голову в сутки, которую скармливали в смеси с монокормом.

Продолжительность эксперимента составила 80 суток, включая 20-дневный подготовительный этап. Для учёта молочной продуктивности применялась доильная установка «DeLaval» с программным обеспечением «DelPro». Контрольные доения проводились ежемесячно дважды в день (утром и вечером). Биохимический анализ молока выполнялся на приборе CombiFoss™7 в лаборатории селекционного контроля качества молока АО «ГПП «Элита».

Для проведения генетических исследований у всех животных были отобраны пробы крови. Анализы осуществлялись в отделе биохимии, генетики, физиологии и питания животных ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН. Выделение ДНК проводили с использованием реагентного набора «Ампли Сенс» ДНК-сорб-В (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Термические условия амплификации фрагментов ДНК представляли собой начальную денатурацию в течение 3 мин при 94 °С с последующими 34 циклами денатурации для 1 мин при 94 °С, отжиг 1 мин при 62,2 °С, элонгация в течение 1 мин при 72 °С и финальная элонгация в течение 7 мин при 72 °С [11]. Комплект однонуклеотидных праймеров (Евроген, Россия):

5’ -TTCAAATCCCGACTCCACCA-3’;

5’- TAACACACAAAAGTCGCCCC-3’.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась с 2 мкл ДНК-образца с компонентами ПЦР-смеси: праймеры (Евроген, Россия), вода деминерализованная, Taq-полимераза, буферный раствор Taq-полимеразы, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (СибЭнзим, Россия). Общий объем – 20 мкл в одной пробирке. Рестрикционный гидролиз продуктов, полученных в ходе ПЦР-реакции, выполняли ферментом Msp I , (СибЭнзим, Россия) при t +37 ºС в течение 16 ч. В 2%-м агарозном геле методом горизонтального электрофореза определяли молекулярный вес рестрикционных фрагментов. Посредством системы Gel&Doc (BIO RAD, США) проводили фиксацию и анализ итоговых результатов.

Локус SNP- Msp I (g.78216220G>A) располагался с нуклеотидной заменой G на A в интроне 1. После этапа рестрикции сформировались фрагменты длиной 225 и 280 п.н. у генотипа KCNB1^GG , 505, 225 и 280 п.н. для генотипа KCNB1^GА и 505 п.н. для генотипа KCNB1^АА соответственно.

Результаты и обсуждение

В результате проведенного исследования установлено, что из всего анализируемого поголовья 33 головы (27,50 %) являлись носителями гомозиготного генотипа KCNB1^АА , 52 головы (43,33%) – гетерозиготного генотипа KCNB1^GА и 35 (29,17%) – гомозиготного генотипа KCNB1^GG . Частота встречаемости аллеля KCNB1^А – 0,49, аллеля KCNB1^G – 0,51.

При оценке динамики молочной продуктивности животных отметили различия, как между подопытными группами, так и в разрезе генотипов (табл. 1).

Таблица 1 – Динамика среднесуточного удоя молока исследуемых коров в разрезе полиморфизма гена KCNB1

	Опытная группа
	на начало опыта			на конец опыта
Генотипы KCNB1	AA (n=18)	GA (n=25)	GG (n=17)	AA (n=18)	GA (n=25)	GG (n=17)
Суточный удой, кг	25,52 ± 2,78	26,39 ± 2,21	26,93 ± 3,04	25,89 ± 2,72	27,10 ± 1,98	28,45 ± 2,86 *
	Контрольная группа
	на начало опыта			на конец опыта
Генотипы KCNB1	AA (n=15)	GA (n=27)	GG (n=18)	AA (n=15)	GA (n=27)	GG (n=18)
Суточный удой, кг	24,98 ± 2,17	26,54 ± 2,14	27,16 ± 2,63	24,21 ± 2,46	26,43 ± 2,12	26,85 ± 2,93

Примечание: * – p ≤ 0,05;

Характер изменений среднесуточного удоя в обеих группах учитывали по сравнению с данными, полученными в начале опытного периода. Так, в группе дойных животных с генотипом KCNB1^АА повысились показатели среднесуточного удоя на 0,37 кг (1,4 %), тогда как в контрольной группе в разрезе этого же генотипа наблюдалось снижение среднесуточного удоя на 0,77 кг (3,08%).

Среди лактирующих коров опытного поголовья с гомозиготным генотипом KCNB1^GG в том же сравнении выявлено значительное повышение значений среднесуточного удоя, которое составило 1,52 кг (5,64 %), в опытной группе с гетерозиготным генотипом – 0,71 кг (2,69 %), тогда как в обеих контрольных группах показатель существенно не изменился.

Отмечены различия в опытной и контрольной группах при их сравнительном анализе между собой в полученных итоговых результатах. Среди группы коров с гомозиготным генотипом KCNB1^АА в опытном поголовье отмечено повышение показателей среднесуточного удоя по сравнению с контрольным поголовьем на 1,68 кг (6,94%), с гомозиготным генотипом – достоверное улучшение на 1,60 кг (5,96%; p ≤ 0,05).

Схожие данные наблюдали Kumari Ragini et al. [10] при исследовании индийского скота породы Са-хивал – KCNB1^GG (9,81±0,91) показал значимо (p ≤ 0,05) более высокие значения по сравнению с генотипами KCNB1^АА (7,46±0,66) и KCNB1^АG (7,55±0,75).

Качественные показатели молока представлены в табл. 2.

Таблица 2 – Качественные показатели молока исследуемых коров в разрезе полиморфизма гена KCNB1

	Опытная группа
	на начало опыта			на конец опыта
Генотипы KCNB1	AA (n=18)	GA (n=25)	GG (n=17)	AA (n=18)	GA (n=25)	GG (n=17)
Массовая доля жира, %	3,78 ± 0,32	3,72 ± 0,24	3,67 ± 0,34	4,02 ± 0,29	3,88 ± 0,18	3,74 ± 0,25
Выход молочного жира, г	958,73 ± 23,98	978,17 ± 19,12	981,44 ± 20,88	1035,52* ± 34,56	1049,11 ± 28,12	1059,26 ± 36,08
Массовая доля белка, %	3,55 ± 0,28	3,54 ± 0,23	3,58 ± 0,29	3,62 ± 0,25	3,61 ± 0,19	3,67 ± 0,29
Выход молочного белка, г	900,77 ± 27,60	930,82 ± 17,78	958,22 ± 31,15	932,68 ± 33,97	975,80 ± 20,11	1038,59** ± 22,96
	Контрольная группа
	на начало опыта			на конец опыта
Генотипы KCNB1	AA (n=15)	GA (n=27)	GG (n=18)	AA (n=15)	GA (n=27)	GG (n=18)
Массовая доля жира, %	3,81 ± 0,23	3,70 ± 0,21	3,62 ± 0,25	3,84 ± 0,24	3,66 ± 0,19	3,64 ± 0,29
Выход молочного жира, г	948,40 ± 25,39	978,98 ± 23,59	978,81 ± 27,57	925,73 ± 36,52	964,65 ± 27,47	971,68 ± 29,20
Массовая доля белка, %	3,55 ± 0,18	3,52 ± 0,20	3,60 ± 0,19	3,49 ± 0,16	3,53 ± 0,18	3,58 ± 0,27
Выход молочного белка, г	884,19 ± 32,15	931,35 ± 22,38	974,43 ± 43,17	842,31 ± 47,17	930,44 ± 27,35	955,96 ± 32,72

Примечание: * – p ≤ 0,05; ** – p ≤ 0,05;

В опытной группе дойных животных с генотипом KCNB1АА повысились показатели массовой доли жира на 0,24 %, выхода молочного жира на 76,79 г (8,01%), тогда как в контрольной группе в разрезе этого же генотипа снижение выхода молочного жира и молочного белка составило 22,67 г (2,39%) и 41,88 г (4,74 %) соответственно.

I 15   1

Среди лактирующих коров опытного поголовья с гетерозиготным генотипом в том же сравнении улучшились значения массовой доли жира на 0,16%, выхода молочного жира на 70,94 г (7,25 %), выхода молочного белка на 44,98 г (4,83 %). При этом же сравнении у контрольного поголовья показатели существенно не изменились.

В опытной группе с гомозиготным генотипом KCNB1^GG по сравнению с данными, полученными в начале исследования, выявлено повышение значений выхода молочного жира и белка, которое составило 77,82 г (7,93%) и 80,37 г (8,39%) соответственно, в то время как в контрольной группе отмечено незначительное снижение по всем показателям.

При сравнительном анализе итоговых результатов между опытной и контрольной группой замечены существенные различия. Среди группы коров с гомозиготным генотипом KCNB1^АА в опытном поголовье отмечено повышение показателя выхода молочного белка на 90,37 г (10,73 %) и достоверное повышение выхода молочного жира на 109,79 г (11,86%; p ≤ 0,05).

Отличались и продуктивные качества между группами коров с гомозиготным генотипом KCNB1^GG : опытные животные превосходили контрольных по выходу молочного жира на 87,58 г (9,01%) и значимо превосходили по выходу молочного белка на 82,63 г (8,64%; p ≤ 0,05).

По данным ряда исследований отмечается, что дрожжевые пробиотические добавки способствуют увеличению потребления сухого вещества, улучшению расщепления клетчатки и переваримости других питательных веществ корма, повышению удоя за лактацию, а также концентрации ЛЖК в рубце и массовой доли жира в молоке [4,6,7]. Увеличения содержания молочного жира может быть связано с влиянием дрожжей на стимуляцию синтеза ацетата в рубце, являющегося предшественником жира молока.

В разрезе полиморфизма гена KCNB1 также проанализирован ряд физико-химических показателей молока исследуемого поголовья (табл. 3).

Таблица 3 - Физико-химические показатели молока исследуемых коров в разрезе полиморфизма гена KCNB1
		KCNB1	1		Сухое вещество, %	Мочевина, мг/100мл	pH	Соматические клетки, тыс/см3
			Лактоза, %	СОМО, %
03 к & к к и в О	о § н и к й ° К	AA (n=18)	4,83 ± 0,09	9,18 ± 0,16	12,68 ± 0,32	15,70 ± 2,35	6,52 ± 0,05	136,25 ± 32,00
		GA (n=25)	4,88 ± 0,06	9,24 ± 0,08	12,91 ± 0,28	16,38 ± 1,96	6,53 ± 0,09	146,38 ± 18,35
		GG (n=17)	4,81 ± 0,04	9,26 ± 0,18	13,13 ± 0,34	16,92 ± 2,92	6,56 ± 0,08	179,28 ± 27,40
	п О 03 ® Ь 9 « к 03 о к	AA (n=18)	4,86 ± 0,11	9,31 ± 0,17	13,05 ± 0,41	17,40 ± 2,54	6,50 ± 0,10	107,44 ± 33,86
		GA (n=25)	4,93 ± 0,05	9,27 ± 0,07	13,26 ± 0,33	16,02 ± 1,35	6,47 ± 0,11	128,14 ± 26,04
		GG (n=17)	4,95 ± 0,06*	9,34 ± 0,16	13,38 ± 0,47	16,49 ± 3,23	6,46 ± 0,13	105,26 ± 21,37**
03 к к & ^ о & t§	о § н S 3 и к 03 ° к	AA (n=15)	4,84 ± 0,09	9,13 ± 0,19	13,01 ± 0,41	17,45 ± 2,51	6,53 ± 0,07	124,77 ± 29,25
		GA (n=27)	4,91 ± 0,07	9,12 ± 0,09	12,79 ± 0,31	15,68 ± 2,07	6,51 ± 0,04	153,00 ± 16,58
		GG (n=18)	4,85 ± 0,10	9,29 ± 0,18	12,95 ± 0,38	16,05 ± 3,21	6,55 ± 0,05	168,13 ± 24,79
	п О 03 ^ к 03 о к	AA (n=15)	4,85 ± 0,12	8,96 ± 0,17	12,94 ± 0,38	18,05 ± 2,80	6,57 ± 0,07	133,18 ± 31,64
		GA (n=27)	4,89 ± 0,05	9,03 ± 0,05	12,72 ± 0,30	16,46 ± 2,03	6,55 ± 0,05	164,32 ± 26,11
		GG (n=18)	4,87 ± 0,09	9,30 ± 0,13	13,21 ± 0,44	15,42 ± 2,91	6,52 ± 0,06	159,87 ± 33,14

Примечание: * – p ≤ 0,05; ** – p ≤ 0,05;

Замечены различия в концентрации мочевины в опытной группе животных с генотипом KCNB1АА по сравнению с изначальными данными – увеличение составило 1,70 мг/100мл (10,83 %), тогда как при том же сравнении в контрольной группе 0,60 мг/100мл (3,44%). Также в опытной группе наблюдалось снижение содержания соматических клеток на 28,81 тыс/см3 (21,14%), в контрольном же поголовье отмечено незначительное повышение. Статистически значимые различия у опытного поголовья в разрезе гомозиготного генотипа KCNB1GG наблюдались в показателях содержания массовой доли лактозы – повышение составило 0,14% (2,91%; p ≤ 0,05), а также соматических клеток – снижение составило 74,02 тыс/см3 (41,29%; p ≤ 0,05), при том, что в контрольной группе не замечены значимые изменения.

Заключение. В условиях Республики Татарстан впервые оценено влияние полиморфизма гена на про- дуктивные качества и физико-химические свойства молока коров голштинской пород при применении дрожжевой пробиотической добавки. Поголовье коров с генотипом KCNB1АА превосходило контрольное поголовье по показателям среднесуточного удоя на 6,94%, выходу молочного белка на 10,73%, в том числе отмечено достоверное повышение выхода молочного жира на 11,86% (p ≤ 0,05). Группа с генотипом KCNB1GG в том же сравнении выгодно отличалась по среднесуточному удою на 5,96%, выходу молочного жира на 9,01% и достоверно превосходила по выходу молочного белка на 8,64% (p ≤ 0,05). Значимые отличия опытного поголовья по сравнению с контрольным отмечены в группе дойных коров с генотипом

KCNB1GG по некоторым физико-химическим показателям молока: содержание массовой доли лактозы увеличилось на 2,91% (p ≤ 0,05), тогда как доля соматических клеток снизилась на 41,29% (p ≤ 0,05).

Финансирование. Статья подготовлена в рамках государственного задания «Совершенствование комплексных отечественных технологий селекции, растениеводства и животноводства на основе идентификации высокоценных генотипов, молекулярногенетических методов, биотехнологий, конструирования адаптивных и высокопродуктивных агробиоценозов и агроэкосистем для производства экологической и функциональной продукции», зарегистрированного по номеру 125031003428-9.