Зерновые биобезопасные напитки для спортивной нутрицевтики

Введение. Растительные безалкогольные напитки на основе зернового сырья с учетом новых технологических решений как источник природных протеинов и углеводов являются полноценным дополнением к рационам питания спортсменов при физических нагрузках [13]. Доказано, что за счет натуральности макро- и микронутриентного состава напитки данной группы эффективны в спортивной нутрицевтике, так как эффективно обеспечивают гидратацию, снижают стресс и усталость после интенсивной физической нагрузки, повышая уровень энергетического «депо». Кроме того, доказана их уникальная способность блокировать развитие старения организма и обеспечивать успешность в спорте старшей возрастной группы, в том числе спортсменов-профессионалов [3, 5].

Спортивная нутрицевтика предполагает включение в состав рационов спортсменов следующих компонентов: дикарбоновые аминокислоты (глутаминовая и аспарагиновая кислоты) как строительный материал для мышц; поливитаминные комплексы в условиях усиленных тренировок; протеины для уве- личения мышечной массы и компенсации затрат энергии; добавки, обладающие жиросжигающим и регенерирующим действием, которые предохраняют суставы от повреждения, ускоряющие заживление травм мышц и связок). Однако формирование полноценных рационов питания при физических нагрузках весьма трудоемко с точки зрения обеспечения ресурсов организма, прежде всего компенсирования энергетических затрат на стадии периода восстановления [11].

Исследователи доказывают, что помимо пищевых добавок и медицинских препаратов пищевой состав основных рационов спортсменов может являться потенциальным источником непреднамеренного допинга [15], что законодательно определено в Общероссийских антидопинговых правилах, утвержденных приказом Минспорта России № 464 от 24.06. 2021 г. Сформирован реестр, который включает спортивное питание (например, спортивные напитки/батончики/гели, протеиновые порошки), отдельные питательные вещества с минералами или витаминами и эрго-генные добавки (например, кофеин, креатин), а также травяные/растительные продукты, в перечне продукты, обогащенные определенными ингредиентами (например, обогащенные витаминами/минералами) и многокомпонентные препараты [12]. Пищевые добавки определяются как: пища, пищевой компонент, питательное вещество или непищевое соединение, которое целенаправленно употребляется в дополнение к обычно потребляемому рациону с целью достижения определенной пользы для здоровья и/или работоспособности [12].

Рост популярности спортивных напитков можно объяснить повышенным осознанием физиологических требований, необходимых для достижения оптимальных результатов в спорте [9]. Спортивные напитки можно определить как напитки, специально разработанные для употребления до или во время физической активности с целью предотвращения обезвоживания, доставки необходимых электролитов (таких как натрий, калий и кальций), обеспечения углеводов и иногда добавления витаминов или других питательных веществ [8].

На фоне предлагаемых разработок в области спортивных напитков в приоритетах важности – использование натуральных ингредиентов на основе местного растительного сырья, в том числе зернового, способного улучшать работоспособность и скорость восстановления и обеспечивать дополнительную пользу для здоровья за счет антиоксидантных, противовоспалительных и др. свойств [6, 7, 14].

Однако при видимой полезности зерновые культуры в длинной цепочке товародвижения могут стать потенциальным источником рисков непреднамеренного до п инга. Так, в экстремальных условиях глобаль н ого изменения климата в зону наблюдений рисков включены вторичные метаболиты отдельных видов токсигенных плесеней, в частности микромицетов родов A s pergillus, P enicillium, A l ternaria and Fusarium. Так, Zeranol , известный как Ralgro , является вторичным метаболитом микотоксина Зеа р аленона (ZEN), прод у цируемого Fusarium spp. во время роста з л аковых и на этапах хранения при нарушении условий. Zeranol (р и с. 1) относится к лакт о нам резорциновой ки с лоты (RALs), а будучи нестероидным анаболическим средством, запрещен к использова н ию в спорте, также с 2019 года официально запрещен к использованию в животноводстве [11].

Вместе с тем Zeranol может быть синтезирован искусственно из ZEN путем гидрирования, продукт экстракции включает смесь α -зеранола и β -зеранола, а структурно связа-ный с микотоксином ZEN может образовываться in vivo в организме животного.

Следовательно, естественное присутствие микотоксинов вторичных метаболитов Fusarium spp. в злаках (кукуруза, пшеница и др.) может обусловить на фоне случайного применения Zeranol непреднамеренные допинговые проблемы [10, 14].

Для оценки вклада пищевых рационов в спортивную нутрицевтику и прогнозирования возможности исключения обозначенных

Рис. 1. Химическая структура Zeranol Fig. 1. Chemical structure of Zeranol

рисков необходимы глубокие исследования, раскрывающие присутствие токсичных соединений в продуктах повседневного рациона, и поиск решений для минимизации возможных проблем.

Цель научного исследования: разработка биобезопасного напитка на основе зернового сырья, применимого для спортивной нутрицевтики в качестве источника дополнительной полезности рационов.

Методология и методы исследования. Достижение цели возможно за счет разработки новых технологических решений получения биобезопасных зерновых напитков, обладающих свойствами полезности, способных компенсировать негативное влияние длительных физических нагрузок на организм человека. Работа осуществлялась поэтапно с учетом комплексности решаемых задач в последовательности от прогностических исследований до формирования доказательной базы данных, применимой в технологиях.

Прогностические исследования оценки безопасности проводили на основе: 1) квантово-химических вычислений с использованием метода Ground state Hartree-Fock (HF) с применением базисного набора 3-21G/ RB3LYP; 2) стратегии in silico «Докинг-анализ». Молекулярное моделирование типов связей проводили с использованием AutoDock 4.2. Стыковку осуществляли методом генетического алгоритма Ламарка (LGA) и проанализировали с использованием инструмента визуализации молекулярной графики PyMOL [1].

В качестве объектов для исследования использовали две партии зерна пшеницы ( Triticum aestivum ) мягкой продовольственной и модельные образцы зерновых напитков. Технология зерновых напитков включала следующие этапы: замачивание (в течение 24–48 часов при температуре 18–20 °С): промывка и мокрое измельчение в гидромодуле 1:2; гомогенизация и настаивание (гидромодуль 1:5 в течение 2 часов при температуре 50 °С); грубая и тонкая фильтрация; пастеризация.

Для обеспечения добавленной полезности готовых зерновых напитков-нутрицевтиков применяли низкочастотный ультразвуковой гомогенизатор Q700 Sonicator (мощность 700 Вт) с зондом 1/2 от Qsonica, длительность воздействия 30 с (40 кГц, 180 Вт).

Для обеспечения биобезопасности применяли «зеленые» технологии нетеплового воздействия на основе атмосферной холодной плазмы (АХП) в разности потенциалов воздействующих полей 8–15 кВт, частота 100 Гц, длительность импульса 1–100 мс (Патент RU 2794769 C1) [2, 4].

Культуру ожидаемой токсигенной микробиоты рода Fusarium spp. получали с использованием способа приготовления живых препаратов для световой микроскопии. Микологическую зараженность оценивали методом высевания на среду Чапека (ГОСТ 12044-93) с использованием электронного микроскопа высокого разрешения Jeol JEM-2100; общую токсичность оценивали на комплексе «БиоЛат» с использованием тест-организмов вида Paramecium caudatum (ГОСТ 31674-2012).

Результаты. На первом этапе исследований проводили квантово-химический расчет и молекулярное моделирование рисков миграции вторичных метаболитов Fusarium spp. микотоксина ZEN в протеиновом комплексе зернового сырья в напитки с целью определения рисков последующих in-vivo трансформаций ZEN в метаболит Zeranol.

Виды рода Fusarium spp. способны продуцировать широкий спектр МТ, среди которых наиболее распространенными и опасными являются Дезоксиниваленол (ДОН), Т-2-токсин, ZEN. Результаты квантово-химических расчетов по перечисленным МТ, полученные методом GFN2-xTB, представлены в табл. 1.

В исследованиях учитывались следующие показатели: общая энергия (Total energy), энергия молекулярных орбиталей HOMO и LUMO, размер энергетического зазора HOMO-LUMO (Homo-LUMO gap), энергия отталкивания электронов (Repulsion energy), вибрационные частоты ИК-спектров, карты электростатического потенциала.

Наибольшее значение энергии отталкивания (Repulsion energy) определено для Т-2-ток-сина и составляет 1,022 Eh (Энергия Хартри). Последовательность, выстроенная по значению показателя Eh: Т-2 (1,022) > ZEN (0,899) ˃ ˃ ДОН (0,673). Значение Total energy, Eh определяет аналогичную последовательность: Т-2 (–95,94) > ZEN (–70,4) ˃ ДОН (–66,64).

Меньший HOMO-LUMO gap часто коррелирует с повышенной реактивностью, так как для возбуждения требуется меньше энергии. Некоторая локализация молекулярных орбиталей HOMO- и LUMO-микотоксинов представлена в табл. 2.

Представленные данные позволяют фиксировать связывающие, не связывающие и

Таблица 1

Table 1

Результаты квантово-химических расчетов микотоксинов с использованием метода GFN2-xTB

Quantum chemical properties of mycotoxins calculated using the GFN2-xTB method

Расчетный параметр Calculated parameter	Микотоксины Fusarium spp. / Fusarium spp. mycotoxins
	ДОН / DON	ЗЕН / ZEN	T-2-токсин / Т-2 toxin
Полная энергия, Eh Total energy, Eh	–66,64	–70,04	–95,94
Энергия HOMO, эВ HOMO energy, eV	–10,2796	–10,2924	–10,7203
Энергия LUMO, эВ LUMO energy, eV	–7,3719	–7,3905	–6,3588
HOMO-LUMO зазор, эВ HOMO-LUMO gap, eV	2,9076	2,9018	4,361
Энергия отталкивания, Eh Repulsion energy, Eh	0,673	0,899	1,022

Таблица 2

Table 2

Локализация молекулярных орбиталей HOMO и LUMO в белково-лигандном комплексе Spatial localization of HOMO and LUMO orbitals in protein-ligand complexes

КОМПЛЕКС ( Глиадин/ДОН/ ЗЕН ) / COMPLEX ( Gliadin/DON/ZEN ) Расчетный параметр / Calculated parameter

Электронная энергия, Хартри: –4272,59 / Electronic Energy, Hartree: –4272,59 Дипольный момент, Дебай: 9,448 / Dipole Moment, Debye: 9,448 Молекулярные орбитали / Molecular orbitals

HOMO

LUMO

разрыхляющие молекулярные орбитали, что важно при оценке миграции МТ в продукты переработки и определении метода блокирования в нутритивной матрице.

При анализе молекулярных орбиталей HOMO и LUMO наблюдаются как связывающие, так и разрыхляющие орбитали. У белковолигандного комплекса, состоящего из белка зерна Глиадина и микотоксинов ДОН и ZEN, наблюдается образование LUMO-орбиталей между белками и микотоксином ZEN (см. табл. 2, выделение красным).

Электронная энергия белково-лигандного комплекса Глиадин/ДОН /ZEN, согласно прогнозам, составила –4272,59, что значимо влияет на стабильность молекул через распределение электронной плотности между атомами и формирует равновесность конфигура- ции системы за счет расположение ядер в пространстве. Дипольный момент (9,448) является мерой полярности молекулы, указывающей на разделение положительных и отрицательных зарядов внутри молекулы, что увеличивает прочность связи.

Анализ стыковки ZEN и метаболита Zeranol (ZRNL) с α-глиадином (8W83) и γ-глиадином (4D8P) (рис. 2) выявил различное сродство к связыванию и характер взаимодействия. ZEN связывается с обоими белками сильнее, о чём свидетельствует его более отрицательная энергия связи (-7,9 ккал/моль с γ-глиадином и -8,5 ккал/моль с α-глиадином) по сравнению с ZRNL (-6,7 ккал/моль и -7,2 ккал/моль соответственно). Это позволяет предположить, что ZEN образует более стабильные комплексы с фракциями глиадина, вероятно, благодаря своей структурной гибкости и способности к множественным взаимодействиям.

ZTN демонстрирует более сильные и разнообразные взаимодействия с протеинами зерна пшеницы, чем ZRNL, что объясняется его способностью образовывать водородные связи, гидрофобные контакты и пи-взаимодействия.

Это предполагает, что ZRL может обладать более высокой склонностью к связыванию с белками пшеницы, что потенциально влияет на его биодоступность или токсичность в пищевых системах. Более слабое связывание ZRNL может быть связано с его более простой структурой и меньшим количеством участков взаимодействия, следовательно, высока вероятность миграции в матрицу напитков.

Результаты прогностических исследований определили необходимость включения в технологию получения зерновых напитков процесса обеззараживания токсигенных мик-ромицетов на основе применения эффектов «зеленых» нетепловых методов воздействия (УЗВ и АХП). Сформирована линейка модельных образцов зерновых напитков на основе зернового сырья пшеницы продовольственной двух партий, подвергнутого нетепловым воздействиям в описанных ранее режимах.

На втором этапе исследований в аспекте применимости для спортивной нутрицевтики модельные образцы зерновых напитков оценивались по показателям биобезопасности

Рис. 2. Взаимодействие зеараленона и зеранола с γ-глиадином (4D8P)

Fig. 2. Interactions of Zearalenone and Zeranol with γ- Gliadin (4D8P)

и пищевой полезности. Следует отметить, что органолептически напитки имели приемлемые потребительские характеристики, а использование нетеплового воздействия заметно улучшало структуру, консистенцию и внешний вид.

Анализ общей токсичности по значению коэффициента выживаемости Paramecium caudatum стал оценочным критерием для скрининга биобезопасности. Результаты степени токсичности напитков по средней выживаемости варьируют в диапазоне для напитков первой партии зерна (партия 1) от 92 ± 10 до 150 ± 10 %, что определяет уровень «нетоксично» для всех модельных образцов напитков данной партии; напитков второй партии зерна (партия 2) от 53 ± 10 до 138 ± 10 %, что определяет уровень «слаботоксично» напитков исходного сырья и после УЗВ-обработки и уровень «нетоксично» после обеззараживания на основе АХП. Установлены образцы с критическими значениями показателя общей токсичности в диапазоне от 53 до 75 %, средние значения ОМЧ достигали 11,2×10⁴ КОЕ/г, количество плесеней – 7,0×10³ КОЕ/г.

Макро- и микроскопически были идентифицированы превалирующие микромице-ты рода Aspergillus и Fusarium spp. , обусловливающие потенциальные риски накопления микотоксинов. Методом MALDI TOF установлен диапазон количества плесневых грибов в исходных пробах зерна от 1,6×10³ до 2,3×10⁵ КОЕ/г. Наибольший коэффициент идентификационного скора зафиксирован для следующих видов: Fusarium spp. (скор 1.959), Aspergillus flavus (скор 1.918), Aspergillus parasiticus (скор 2.054).

Контроль биобезопасности проб зерна на присутствие микотоксинов дал положительные результаты идентификации вторичного метаболита Fusarium spp. ‒ Дезоксиниваленол (ДОН) на уровне 58 мкг/кг и отрицательный результат на присутствие Зеараленона (ZEN), что тем не менее в целях предупреждения рисков определяет необходимость применения технологий обеззараживания исходного зернового сырья.

Оценка потенциальной биоактивности образцов напитков (табл. 3) на модели пищеварения in vivo позволила спрогнозировать миграцию биоактивных нутриентов зерна пшеницы в напитки, формируя их нутритивную полезность. Важным фактором, определяющим нутритивную полезность напитков для спортивного питания на фоне биобезопасности, выступает скорость включения пищевых нутриентов в процессы метаболизма и восстановления энергетического депо организма после физической нагрузки.

Используя «зеленые» технологии при производстве зерновых напитков, возможно обеспечить не только сохранение ценных макро- и микронутриентов, но обеспечить эффективность их усвоения, о чем свидетельствуют представленные результаты. В совокупности природных антиоксидантов пищевых злаков большая их часть содержится во внешней оболочке зерен, отруби содержат до 80 % антиоксидантов, поэтому цельные продукты переработки зерна являются неоспоримо более полезными.

Оценивая данные суммарного содержания антиоксидантов (ССА галловая кислота, мг/100г) для зерна пшеницы, которые составляют от 36 до 63 мг/100 г в сопоставлении со значениями общей антиоксидантной активности напитков, можно отметить устойчивые высокие значения на уровне от 43 до 57 %, DPPH.

Состояние дисперсии композиции напитков зависит от исходного состояние зерновой массы и используемого метода нетеплового воздействия. Фактические изменения дисперсии напитка, безусловно, определяют доступность нутриентов к перевариванию, но индекс биоактивности указывает на полноценное наполнение системы организма биоактивными компонентами антиоксидантного действия. Прослеживается значения ИБА в третьей фазе тонкого кишечника на уровне от 69,82 до 74,24 % для всех модельных образцов напитков независимо от партии сырья. Результаты оценки потенциальной биоактивности модельных образцов зерновых напитков согласуются с данными ИК-Фурье-спектроскопии (рис. 3).

Полосы поглощения при 3460 см1, 2918 см1, 1645 см1, 1541 см1, 1030 см1 и 573 см1 соответствуют: спиртовым связям O–H (предполагает наличие гидроксильных групп), C–H (алифатический углеводород), C=O (полоса амид I указывает на связь с белками/пептидами или кетонами/альдегидами), C–N (деформация NH, полоса амид II), C–O (характерна для полисахаридов и простых эфирных связей) и валентным колебаниям α-гликозидных связей соответственно.

Все исследованные образцы напитков (1-я партия зерна – образцы напитков 1–3,

Таблица 3

Table 3

Результаты оценки потенциальной биоактивности модельных образцов зерновых напитков

Bioactivity potential of model grain-based drinks

Исследуемые образцы Tested samples	Дисперсия композиции, медианное значение, (нм) Composition dispersion, median (nm)	Общая антиоксидантная активность, % (DPPH) Total antioxidant activity, % (DPPH)	Индекс биоактивности (ИБА) 3-я фаза тонкого кишечника (%) Bioactivity index (BAI) Small intestine phase 3 (%)
Модельные зерновые напитки (1-я партия зерна) Model grain-based drinks (1st grain batch)
ЗН 1 -контроль GD 1 Control	140,4	59,49	74,24
ЗН 1 –УЗВ GD 1 –US	657,0	55,48	73,77
ЗН 1 –АХП GD 1 –AGP	241,3	50,76	73,82
Модельные зерновые напитки (2-я партия зерна) Model grain-based drinks (2nd grain batch)
ЗН2-контроль GD2 Control	236,6	57,90	69,82
ЗН 2 –УЗВ GD 2 –US	850,0	55,41	72,83
ЗН 2 –АХП GD 1 –AGP	398,0	43,18	72,78

Рис. 3. Сравнение ИК-спектров образцов

Fig. 3. Comparison of FTIR spectra between samples

2-я партия зерна – образцы напитков 4–6) имеют схожие спектральные полосы, интенсивность спектров в обозначенных полосах незначительно изменяется. Тем не менее наблюдается небольшое изменение (уменьшение) интенсивности, следовательно, структура незначительно изменяется при обработке ультразвуком (образцы 2 и 5) и атмосферной холодной плазмой (образцы 3 и 6).

Заключение. В исследовании было применено многофакторное исследование для разработки технологии биобезопасных зерно- вых напитков-нутрицевтиков, применяемых в спортивном питании. В качестве основной цели было определено прогностическое и фактическое исследование присутствия рисков миграции микотоксинов продовольственного зернового сырья в дисперсию напитков и определены технологические подходы для минимизации рисков их возможной трансформации в организме потребителя. В качестве модели оценены «зеленые» технологии обеззараживания на основе нетепловых эффектов низкочастотного ультразвука и атмосферной холодной плазмы для исключения возможности случайного непреднамеренного проглатывания микотоксинов.

На основании полученных данных было установлено, что применение нетепловых методов обеззараживания значительно снижает общую токсичность напитков, использование эффектов атмосферного холодноплазменного воздействия обеспечивает высокую выживаемость простейших от 92 ± 10 до 150 ± 10 %, что определяет уровень критерия оценки как «нетоксично» для всех модельных образцов напитков. Оценка присутствия в напитках вторичного метаболита Зеараленона (ZEN) показала отрицательный результат, что тем не менее в целях предупреждения рисков определяет необходимость применения технологий обеззараживания исходного зернового сырья.

Установлено, что применение «зеленых» технологий обеспечивает сохранение в напитках биоактивных свойств нативных нутриентов зерна пшеницы, что подтверждается высоким значением антиоксидантной активности на уровне от 43 до 57 %, DPPH. Прослеживаются значения ИБА в третьей фазе тонкого кишечника на уровне от 69,82 до 74,24 % для всех модельных образцов напитков.

Разработанный подход может быть рекомендован для внедрения на предприятиях пищевой отрасли в условиях стратегии разработки импортозамещающих технологий и ресурсосбережения вторичного сырья.