Жизнеспособность побегов и пыльцы плодовых культур при действии низкой и сверхнизкой температуры

Для сохранения вегетативно размножаемых растений, в частности плодовых и ягодных культур, в последние десятилетия успешно используют методы культуры клеток, тканей и органов in vitro (1-3). Перспективными оказались культуры стеблевых апикальных и пазушных меристем, из которых на питательной среде развиваются растения, минуя каллусообразование (4). Меристемы генетически стабильны, их клетки однородны и соответствуют исходному генотипу. Кроме того, клетки меристемы не содержат патогенов, поэтому из нее можно получать здоровые растения. Однако этот прием имеет существенный недостаток — непрерывный рост всего несколько месяцев, после чего культуру in vitro необходимо пересаживать на свежую питательную среду. Один из способов решения проблемы хранения растений — сочетание методов культуры клеток и тканей и глубокого замораживания до температуры, при которой полностью прекращаются процессы жизнедеятельности в клетках. Судя по результатам модельных опытов, биологический материал можно хранить при температуре –196 оС десятки и сотни лет в неизменном состоянии (5-7). Так, показано, что побеги древесных растений, подвергнутые медленному замораживанию до –60 оС, а затем помещенные в жидкий азот (–196 оС), после оттаивания возобновляли рост, укоренялись и хорошо развивались (8). Установлено, что ветви и почки морозоустойчивых деревьев, в том числе и плодовых, способны выживать после погружения в жидкий азот (9). Успех этих опытов объясняется тем, что применение медленного замораживания биоматериала до –40…–60 оС приводит к постепенному обезвоживанию: в клетках остается менее 10 % воды. После такого обезвоживания клеток погружение растительного материала в жидкий азот уже не опасно, так как не вызывает образования льда. Успешное применение криопротекторов перед охлаждением позволило расширить границы устойчивости образцов, сократить время и повысить скорость замораживания (9, 10).

Кроме замораживания тканей, меристем, почек плодовых культур в некоторых случаях целесообразно применять криоконсервацию пыльцы. Хранение пыльцы плодовых позволяет сберечь генетический материал наиболее продуктивных и ценных по хозяйственным признакам сортов для осуществления планируемых скрещиваний, независимо от наличия свежесобранной пыльцы.

Одним из критериев сохранности пыльцы в условиях низкотемпературного и криогенного хранения является ее жизнеспособность. В естественных условиях жизнеспособность пыльцы растений разных видов различается: от нескольких часов (у злаков) до нескольких месяцев (у плодовых, табака) и даже лет (у пальм) (11). На жизнеспособность пыльцы заметно влияют погодные условия, при которых происходит формирование и созревание пыльцевых зерен (12, 13). Лучшими условиями для сохранения жизнеспособности пыльцы являются низкая влажность и невысокая температура воздуха (12, 14). В сухом состоянии пыльца может переносить очень низкие температуры (–196 оС), не теряя своей жизнеспособности и фертильности (11, 14-16).

В настоящей работе мы исследовали влияние различной температуры хранения на жизнеспособность побегов и пыльцы плодовых культур.

Методика. Отбор вегетативных побегов (черенков) проводили в коллекционном саду Павловской опытной станции ВИР в сроки, когда плодовые деревья находились в состоянии глубокого покоя (декабрь-январь) и в период выхода из глубокого покоя (февраль-март). Объектом исследования служили сорта яблони (Коричное полосатое, Зимнее наслаждение, Винное), груши (Ольга, Павловская поздняя, Местная), вишни (Владимирская, Жигарская, Краса Татарии) и сливы (Скороспелка красная, Тульская черная и др.). Нарезали по 20-25 черенков каждого сорта (в двух повторностях), затем их плотно заворачивали во влажную ткань (чтобы не подсыхали), упаковывали в полиэтилен и помещали в холодильники марки «Huurre» (Финляндия). Черенки предварительно закаливали, выдерживая 1 сут при 0 ^оС и 2 сут при – 2...–3 ^оС, после чего их оставляли на длительное хранение (10 мес) при –5 и –20 ^оС.

Жизнеспособность размороженных черенков после 10 мес хранения определяли посредством проращивания в воде и гистологическим методом (поперечные срезы древесины и почек). Повреждение срезов оценивали по 6-балльной шкале (5): 0 — нет повреждений; 1, 2, 3, 4 и 5 — повреждено соответственно 10-15, 25, 40-50, 75 и 100 % от всей площади тканей.

Сбор и подсушивание пыльцы яблони осуществляли в коллекционном саду ПОС ВИР, согласно методическим указаниям (14). Часть подсушенной пыльцы использовали для определения исходной жизнеспособности, остальную помещали в контейнеры с пробирками фирмы «Nunс» (Дания) и закладывали на хранение при разной температуре: 2, –20 и –196 оС.

Замораживание пыльцы до сверхнизкой температуры осуществляли прямым погружением пробирок с пыльцой в жидкий азот, основываясь на данных Сытника с соавт. и собственных исследований (2, 10, 11). Размораживание проводили на водяной бане при температуре 37 оС в течение 1 мин.

Жизнеспособность пыльцы оценивали методом проращивания на искусственной среде, содержащей 15 % раствор сахарозы на 0,5 % растворе агар-агара. Одновременно определяли долю нормально выполненных пыльцевых зерен методом окрашивания в ацетокармине. Число проросших и окрашенных ацетокармином пыльцевых зерен подсчитывали под микроскопом при 100-кратном увеличении в 810 полях зрения в 3-кратной повторности.

Результаты . Анализ срезов древесины и почек после размораживания черенков показал, что после хранения при –5 ^оС их жизнеспособность была выше, чем после хранения при –20 ^оС (табл. 1). Однако в обоих вариантах наблюдалась зависимость жизнеспособности черенков от сроков их отбора. Срезанные в период глубокого покоя черенки лучше сохранялись, имели здоровую вызревшую древесину светлой окраски. На побеги, взятые в период выхода из глубокого покоя, оказывали отрицательное влияние оттепели и возврат морозов. Наиболее устойчивыми к замораживанию были следующие сорта: яблони — Коричное полосатое и Зимнее наслаждение; груши — Ольга и Павловская поздняя; вишни — Владимирская; сливы — Скороспелка красная и Тульская черная.

• 1.    Оценка жизнеспособности и скорости прорастания черенков плодовых культур после хранения при температуре –5 и –20 ^оС

  Культура	Сорт	Степень повреждения черенков		Скорость прорастания черенков после оттаивания, сут
  		балл	%
  	Т е м п е р а т у р а х р а н е н и я –5 оС
  Яблоня	Коричное полосатое	0	0	7
  	Зимнее наслаждение	2	25	11
  	Винное	4	75	9
  Груша	Ольга	0	0	4
  	Павловская поздняя	2	25	6
  	Местная	3	40	7
  Вишня	Владимирская	0	0	4
  	Жигарская	1	10-15	5
  	Краса Татарии	2	25	7
  	Т е м п е р	а т у р а х р а н е н и я –20 оС
  Яблоня	Коричное полосатое	2	25-30	12
  	Зимнее наслаждение	3	50	15
  	Винное	4	75-80	14

  Груша	Ольга	2	25-30	9
  	Павловская поздняя	2	50-60	17
  	Местная	2	75-80	16
  Вишня	Владимирская	3	45-50	7
  	Жигарская	4	75	11
  	Краса Татарии	3	75-80	14

  Исходная жизнеспособность пыльцы, определяемая методом проращивания на искусственной среде, зависит как от сортовых особенностей, так и от погодных условий в период ее формирования. Жизнеспособность пыльцы сортов яблони Июльская Петрова, Теллисаари, Крапчатое, Скрижапель и образца ¹ 88 сбора 2001 года была ниже, чем тех же сортов сбора 2002 года (табл. 2 и 3). Это можно объяснить тем, что погодные условия в период формирования и созревания пыльцы яблони в 2002 году были более благоприятными, чем в 2001 году. Окрашивание пыльцы яблони ацетокармином, характеризующее ее зрелость, не всегда коррелировало со способностью к прорастанию.

• 2.    Жизнеспособность пыльцы яблони различных сортов в зависимости от срока и температуры хранения (сбор 2001 года)

• 3.    Жизнеспособность пыльцы яблони различных сортов в зависимости от срока и температуры хранения (сбор 2002 года)

Опыты по хранению пыльцы при различной температуре (2 и –20 оС) в течение 3 мес и более (1-2 года) показали, что для большинства сортов яблони наиболее благоприятной была температура –20 оС (10) (см. табл. 2).

* HCP при 5 % уровне достоверности.

Не обнаружено достоверных различий по жизнеспособности пыльцы после ее хранения при температуре –20 и –196 оС в течение 1 года (см. табл. 3).

* HCP при 5 % уровне достоверности.

Как и в предыдущих работах, мы наблюдали сортовые различия по жизнеспособности пыльцы после хранения при низкой температуре (10, 11). Жизнеспособность пыльцы исследованных сортов яблони, собранной в 2002 году, после 1 года хранения при –20 оС оставалась на исходном уровне; жизнеспособность же пыльцы, собранной в 2001 году, при хранении в течение 1 года при тех же условиях заметно снижалась у половины исследованных сортов. При хранении пыльцы в течение 1 года не выявлено преимущества криоконсервации перед низкотемпературным режи- мом. Для этого срока хранения температура –20 и –196 оС оказалась одинаково приемлемой.

Таким образом, при хранении побегов плодовых растений при –5 оС доля жизнеспособных черенков выше, чем при –20 оС. На жизнеспособность и скорость прорастания черенков оказывают влияние сроки отбора: черенки, срезанные в период глубокого покоя (декабрь-январь), имеют вызревшую древесину, их сохранность выше, хотя они отстают при прорастании на 2-3 сут от черенков, срезанных в период выхода из глубокого покоя (февраль-март). Жизнеспособность пыльцы зависит как от эколого-генетических факторов, так и от сортовых особенностей образцов. Пыльцу плодовых растений можно хранить в течение 1 года как при –20, так и при –196 оС.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    П о п о в А.С. Физиология криоустойчивости и криосохранения культивируемых in vitro клеточных штаммов растений. Автореф. докт. дис. М., 1998: 15-17.

• 2.    С ы т н и к К.М., М а н у и л ь с к и й В.Д. Криоконсервация и длительное хранение эмбриоидов и пыльцы растений. Пущино, 1983: 5-31.

• 3.   Б у т е н к о Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология растений. М., 1964.

• 4.   К а т а е в а Н.В., Б у т е н к о Р.Г. Клональное микроразмножение растений. М., 1983.

• 5.   Г о л у б и н с к и й И.Н. Биология прорастания пыльцы. Киев, 1974: 88-107.

• 6.   С о л о в ь е в а М.А. Формирование признаков морозостойкости плодовых растений и методы оценки

  селекционного материала на устойчивость к низким и переменным температурам. В сб.: Селекция плодовых и ягодных культур. Новосибирск, 1998: 15-25.

• 7.    F o r s l i n e P.L., T o w i l l L.E., W a d d e l J.W. e.a. Recovery and longevity of cryopreserved dormant apple buds. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 1998, 123(3): 365-370.

• 8.    Т у м а н о в И.И., К р а с а в ц е в О.А., Х в а л и н Н.Н. Повышение морозостойкости березы и черной смородины до –253 ^oC путем закаливания. Докл. АН СССР, 1959, 127, 6: 1301-1303.

• 9.    S a k a i A., N i s h i y a m a Y . Cryopreservation of winter vegetative buds of hardy fruit trees in liquit nitrogen. Hort. Sci., 1978, 13, Section 1, 3: 225-228.

• 10.    С а ф и н а Г.Ф., Т и х о н о в а Н.Г . Жизнеспособность пыльцы яблони при различных режимах хранения. В сб.: Генетические ресурсы культурных растений. СПб, 2001: 49-50.

• 11.    V e r z h u k V., S a f i n a G., T i k h o n o v a N. e.a. Viability of fruit crop scions and apple pollen stored at low and ultralow temperatures (Crioconservation). Agriculture. Scientific Articles, 2002, 78, 2: 283-288.

• 12.    Д у г а н о в а Е.А. О жизнеспособности пыльцы яблони, груши и айвы. Тр. по прикл. бот., ген. и сел. Л., 1973, 40, 3: 43-49.

• 13.    К а л и н и н Ф.Л., С а р н а ц к а я В.В., П о л и щ у к В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980.

• 14.    Н е с т е р о в Я.С . Изучение коллекции семечковых культур и выявление сортов интенсивного типа. Метод. указ. Л., 1986: 69-75.

• 15.    С т е н в у д Р.С., Б э с с Л.Н. Сохранение зародышевой плазмы путем глубокого охлаждения семян. В кн.: Холодостойкость растений. М., 1983: 280-287.

• 16.    Ф и л и п п о в а Т.В. Возможность длительного хранения пыльцы кукурузы при температуре –196 ^oС. В сб.: Теоретические основы селекции. Новосибирск, 1985: 64-68.