Значение маркеров прогрессии при остеосаркомах у детей

Злокачественные новообразования костей, составляя около 10 % всех опухолей у детей, встречаются преимущественно во втором десятилетии жизни и отличаются крайне агрессивным течением. Во многих случаях они выраженной терапевтической резистентностью нередко требуют проведения калечащих хирургических вмешательств – ампутаций и экзартикуляций конечностей. До 50–70 % всех наблюдений злокачественных опухолей скелета приходится на долю остеогенной саркомы [4].

В настоящее время информация о прогностической значимости молекул, экспрессирующихся при опухолевой прогрессии, весьма противоречива [1, 10]. Предполагается, что одним из значимых прогностических маркеров может являться уровень апоптоза в ткани опухоли. Известно, что низкий уровень спонтанного или индуцированного апоптоза опухолевых клеток может быть основой развития устойчивости к противоопухолевой терапии [7]. Другим возможным прогностическим маркером химиорезистентности может быть показатель пролиферации. Одним из белков, связанных с пролиферацией, является антиген Ki-67. Антитела к антигену Ki-67 реагируют с пролифе- рирующими (G1, S, и G2 стадии клеточного цикла), но не с покоящимися клетками (стадия G0), что используется для оценки фракции растущих клеток в опухолях [3].

Особое место в развитии прогрессирования опухоли отводится лекарственной устойчивости, которую предлагается учитывать как важный прогностический фактор. Одним из важнейших механизмов химиорезистентности опухолевой клетки может быть гиперэкспрессия генов, ответственных за экструзию цитостатиков из клетки (транспортные гены семейства множественной лекарственной устойчивости: multidrug resistance gene-1-MDR-1) [8, 9]. Ген MDR-1 кодирует транспортный белок Р-гликопротеин (Pgp), который является трансмембранным АТФ-зависимым насосом, удаляющим химические вещества из клеточной цитоплазмы, в том числе и препараты, использующиеся для лечения опухолей [2, 5, 6].

Таким образом, научные работы по рассматриваемой проблеме не имеют единой интерпретации, носят преимущественно экспериментальный характер, а исследования по изучению состояния апоптоза, пролиферации и химиорезистентности при остеосаркомах у детей с их оценкой на фоне химиотерапии практически отсутствуют.

Цель исследования . Оценка прогностической значимости некоторых маркеров апоптоза, пролиферации и мультилекарственной устойчивости у детей с остесаркомами.

Материал и методы

Наблюдались 17 детей с морфологически подтвержденным диагнозом остеогенная саркома, находившихися в отделении онкологии/ гематологии Краевой детской клинической больницы в 2004–2006 гг. Пациенты группировались по полу, возрастным группам, исходу, наличию метастазов. Клинические проявления заболевания у пациентов исследуемой группы оказались классическими и не отличались от описанных в литературе. Для лечения использовались протокольные схемы терапии, принятые в России.

Детекция апоптоза проводилась методом TUNEL (TdT-mediated dUPT nick end labeling) в депарафинизированных срезах опухолевой ткани при помощи набора Mebstain Apoptosis Detection kit (Immunotech, France) согласно протоколу фирмы-производителя. Регистрация апоптоза осуществлялась при микроскопии среза (люминесцентный микроскоп «Люмам-8»), результаты архивировались и анализировались с помощью приставки «Nikon Coolpix 4500». Подсчитывалось общее количество TUNEL+ клеток не менее чем в 20 полях зрения (х900) с последующим расчетом апоптозного индекса на 300 клеток (АИ – доля TUNEL+ клеток, выраженная в процентах от общего количества клеток). За низкий уровень апоптоза принимались значения – от 0 до 5 %. За умеренный от 5,1 до 10 %. Апоптозный индекс выше 10,1 % расценивался как высокий.

Определение экспрессии антигенов Ki-67 и Р-гликопротеина проводилось двойным непрямым методом иммуноферментного окрашивания. Для определения Ki-67 использовались первичные моноклональные антитела MIB-1 в рабочем разведении 1:100 (DAKO, Дания) в PBS с 1 % WGS. Антителами для Р-гликопротеина были первичные мышиные антитела JSB1 в рабочем разведении 1:50 (Novocastra, Англия) в PBS с 1 % WGS. В качестве вторичных антител использовались

ФИТЦ-меченые антимышиные моноклональные антитела (Сорбент, Москва) в разведении 1:200 в PBS с 1 % WGS. Иммуногистохимические исследования проводились по стандартной методике в депарафинизированных срезах. Использовалась люминесцентная (УФ, зеленый светофильтр) микроскопия (х900). Производили подсчет 300 клеток для выявления процентного соотношения позитивных и негативных клеток. Для каждого образца готовился негативный контроль. Образцы опухоли расценивались как отрицательные при отсутствии окраски. Для определения выраженности пролиферативной активности рассчитывался пролиферативный индекс (ПИ – доля Ki-67+ клеток, выраженная в процентах от общего количества клеток). Положительные результаты ранжировались в интервале от 1 до 3 следующим образом: слабое окрашивание менее 10 % клеток – 1, слабое окрашивание более 10 % клеток – 2, сильно выраженное окрашивание более 10 % клеток расценивалось как 3. На основании результатов окраски повышенным уровнем считались образцы со степенью 2 и 3.

До проведения статистического анализа оценивался характер распределения каждого показателя на нормальность. Для оценки статистической значимости количественных показателей с нормальным распределением использовались методы параметрической статистики (средняя арифметическая и стандартное отклонение, критерий Стьюдента, при уровне значимости р<0,05). Для показателей, не имеющих нормального распределения, использовались методы непараметрической статистики (различия количественных показателей между двумя группами оценивались по критерию Колмогорова–Смирнова, сравнение трех и более групп осуществлялось с использованием критерия Крускала–Уоллиса, сравнение групп до и после лечения проводилось с использованием критерия Уилкоксона при уровне значимости р<0,05). Для сравнения показателей, выраженных в процентах, рассчитывалась ошибка долей с определением статистической значимости при помощи критерия z с поправкой Йетса на непрерывность. Бессобытийную выживаемость рассчитывали с момента начала исследования до возникновения события, которыми считались рецидив, смерть, потеря из-под наблюдения, в соответствии с методом Kaplan–Meier.

Результаты и обсуждение

Характеристика апоптотической активности. Выполненный анализ на выраженность апоптоза показал следующее: в 16 (94 %) исследованных образцах остеогенной саркомы, полученных до начала терапии, уровень АИ был высоким – 24 ± 2,4, в 1 (6 %) умеренным – 9. После проведения лечения во всех 17 образцах уровень АИ расценен как высокий – 31,9 ± 3,2 (таблица). При этом для детей обоих полов он составил 23,1 ± 2,6 до терапии и значительно увеличился – до 31,9 ± 3,2 – на фоне проводимой терапии (р=0,02). Исследовав указанный параметр с учетом пола пациентов, мы выявили, что нет никаких различий величины АИ у мальчиков и девочек до лечения (p>0,05). Однако после проведения терапии у мальчиков АИ оказался значительно выше, чем у девочек (р=0,019).

Изучая гендерное влияние на бессобытий-ную выживаемость, мы установили значимые отличия (р=0,044) в длительности выживаемости детей разного пола. У мальчиков выживаемость была значительно выше. Учитывая, что на фоне терапии уровень АИ увеличился, только у пациентов мужского пола можно предположить влияние АИ на выживаемость.

Определение пролиферативной активности. Исследуя состояние пролиферации в образцах остеосарком у детей, было установлено, что до начала терапии в 4 исследуемых образцах (23,5 %) пролиферативный индекс был низким – 4,8 ± 1,5, в

13 (76,5 %) увеличенным – 21,9 ± 3,2. После проведения лечения в 9 (53 %) образцах уровень ПИ оказался низким – 6,2 ± 1,1, в 8 (47 %) высоким – 19,4 ± 2,1. При этом для детей обоих полов отмечается значительное снижение пролиферативной активности на фоне проводимой терапии (17,8 ± 3 до терапии, после – 12,4 ± 1,9 (р=0,02)). Исследовав указанный показатель с учетом пола детей, установлено отсутствие гендерных различий до и после терапии (p>0,05). С учетом возрастной структуры пациентов сравнивались две подгруппы – 0–10 лет и 11–17 лет. При этом отмечается значительное уменьшение данного параметра на фоне химиотерапии в обеих подгруппах (р<0,02). Однако в обеих подгруппах ПИ не отличался до и после лечения (p>0,05). Определяя выраженность пролиферации в подгруппах детей, у которых наступил летальный исход, и выживших, мы выявили достоверно более низкий ПИ у выживших детей (таблица). В подгруппе детей с метастазами опухоли определено значимое преобладание ПИ (p<0,05) как до, так и после химиотерапии. В подгруппе детей без метастазов пролиферация была низкой как до, так и после проведения лечения (10 ± 1,6 и 7 ± 1,2).

В ходе работы были установлены значительные различия длительности выживаемости при различной степени пролиферации (р=0,01). При этом отмечается, что время бессобытийной выживаемости при высоком уровне ИП ниже, чем при низком уровне пролиферации. Имеются значимые отличия (р=0,044) в выживаемости детей разного пола: у мальчиков выживаемость значительно выше.

Таблица

Иммуногистохимическая характеристика остеосарком (М±δ)

Группы больных	АИ		ПИ		Pgp
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
Мальчики (n=11)	25,7 ± 3,9	37,6 ± 4 # *	13,6 ± 3,2	9,9 ± 2,5*	8,3 ± 2,1 #	8,1 ± 1,4 #
Девочки (n=6)	19,4 ± 2,2	23,9 ± 3,5 # *	28,9 ± 5,3	16 ± 2,8*	23 ± 2,5 #	18,4 ± 2,2 #
Все дети (n=17)	23,1 ± 2,6	31,9 ± 3,2*	17,8 ± 3	12,4 ± 1,9*	14,4 ± 2,4	12,2 ± 1,7
11–17 лет (n=14)	22,9 ± 3	32,4 ± 3,7*	17,3 ± 3,6	11,8 ± 2,3*	13 ± 2,3 #	11 ± 1,6 #
0–10 лет (n=3)	24 ± 4,4	29,7 ± 6,7*	20,3 ± 4,3	15,3 ± 3,7*	20,7 ± 8,3 #	17,7 ± 5,9 #
Живы (n=9)	28,4 ± 3,8 #	41,7 ± 3,5 # *	9,2 ± 1,6 #	6,6 ± 1,1 # *	6,8 ± 1,8 #	7 ± 1,1 #
Умершие (n=8)	17,1 ± 1,7 #	20,9 ± 0,8 #	27 ± 4,3 #	19,1 ± 2,2 # *	22,9 ± 2 #	18,1 ± 1,8 #
Метастазы (n=9)	22,4 ± 4,3	28,3 ± 4,6	24,2 ± 4,7 #	17,3 ± 2,6 # *	18,8 ± 3,5 #	15,8 ± 2,4 #
Без метастазов (n=8)	23,9 ± 2,7	36 ± 4,2*	10 ± 1,6 #	7 ± 1,2 # *	9,4 ± 2,3 #	8,3 ± 1,5 #

Примечание: * – р<0,05 при сравнении одной подгруппы до и после лечения (критерий Уилкоксона); # – р<0,05 при сравнении подгрупп между собой (критерий Манна–Уитни и критерий Крускала–Уоллиса).

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2008. №5 (29)

Характеристика лекарственной устойчивости. Исследуя выраженность экспрессии Р-гликопротеина в образцах остеосарком у детей, мы установили, что до начала терапии в 6 (35 %) исследуемых образцах экспрессия была низкой – 3,3 ± 0,6, в 11 (65 %) высокой – 20,4 ± 1,9. После проведения лечения в 8 (47 %) образцах уровень этого показателя расценен как низкий – 6,3 ± 0,9, в 9 (53 %) как высокий – 17,6 ± 1,7. При этом для детей обоих полов он составил до терапии – 14,4 ± 2,4 и незначительно снизился (до 12,2 ± 1,7) на фоне проводимой терапии (p>0,05). Исследовав указанный показатель с учетом пола пациентов, мы выявили, что у девочек с остеосаркомами экспрессия Pgp была высокой и значительно выше до (р=0,003) и после лечения (р=0,005), чем у мальчиков. На фоне лечения происходило незначительное изменение показателя экспрессии Pgp. Более высокие показатели выраженности экспрессии маркера лекарственной устойчивости выявлены в подгруппах умерших детей и пациентов с метастазированием опухоли. Изучая возрастные особенности экспрессии Р-гликопротеина в ткани остеосарком, в подгруппе 0–10 лет отмечено прогностически неблагоприятное повышение Pgp (экспрессия была значимо (р<0,046) выше до и после лечения).

Установлены отличия выживаемости при различной степени экспрессии Pgp (р=0,02). У детей, в опухолях которых определялась низкая экспрессия Р-гликопротеина, длительность бес-событийной выживаемости была значительно больше, чем у детей с высокой экспрессией. Отсюда можно сделать вывод о влиянии уровня Pgp на выживаемость.

Выводы. В ходе исследования особенностей молекулярных механизмов опухолевой прогрессии (уровень апоптоза, пролиферативная активность, экспрессия маркера лекарственной устойчивости) при остеогенной саркоме у детей установлено:

– Отсутствие половых и возрастных отличий уровней апоптоза до начала лечения и более низкие значения исследуемого параметра у умерших детей, увеличение указанного параметра после химиотерапии, а также более низкая апоптотическая активность у пациентов женского пола и умерших детей.

– Отсутствие значимых половых и возрастных отличий экспрессии антигена Ki-67 до и после химиотерапии.

– Высокое значение пролиферативного индекса у умерших детей и при метастазирующих опухолях, а также снижение активности пролиферации на фоне химиотерапии с сохранением указанных выше особенностей.

– Более короткое время бессобытийной выживаемости детей с высокими показателями пролиферативной активности.

– Повышенные показатели выраженности экспрессии маркера лекарственной устойчивости у девочек, в подгруппах умерших детей и пациентов с метастазированием опухоли (прогностически неблагоприятное повышение Pgp отмечено в возрастной подгруппе 0–10 лет).

– Влияние экспрессии Р-гликопротеина на продолжительность бессобытийной выживаемости (при высоких значениях экспрессии Pgp время бессобытийной выживаемости значительно меньше).