Значение методов окрашивания ооцист при диагностике криптоспоридиоза телят

Криптоспоридиоз – протозойное паразитарное заболевание животных и человека, вызываемое простейшими семейства Cryptosporidiidae, с преимущественным поражением желудочного кишечного тракта, дыхательной и иммунной систем организма. Криптоспоридии являются внутриклеточными облигатными паразитами.

Ооцисты криптоспоридий округлой формы, бесцветной полупрозрачной оболочкой тонкой оболочкой, с диаметром ооцист 4,6 – 6,3 * 3,6 – 5,4 мкм. В цитоплазмы имеется остаточное тельце, вокруг которого располагается 4 спорозоита [2].

К настоящему времени за рубежом и в нашей стране опубликовано много научных работ по биологии возбудителя криптоспоридиоза, клинической картины, патогенеза, диагностики эпизоотологии, профилактики и терапии. Однако, несмотря на это, в ветеринарной практике криптоспоридиоз почти не диагностируется, и он не отражается в ветеринарных отчетах.

Диагноз на криптоспоридиоз устанавливают на основании лабораторных исследований фекалий (прижизненно) и патологического материала (посмертно), с учетом эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных. Для лабораторной диагностики криптоспоридиоза из фекалий молодняка животных применяются методы окраски по Циль-Нильсену с карболовым фуксином, по Кестеру с сафранином, по Романовскому-Гимзе и негативное окрашивание с нигрозином [1]. Вместе с тем, указанные методы не всегда позволяют обнаруживать в мазках фекалий ооцист криптоспоридий. Поэтому диагностика данной инвазии требуют дельнейшего усовершенствования.

Исходя из вышеизложенного, целью нашего исследования являлось установление наиболее эффективного метода окраски криптоспоридий в мазках фекалий.

Материал и методы. Для диагностики криптоспоридиоза брали пробы фекалий от новорожденных телят из хозяйств Балтасинского, Кукморского и Сабинского районов республики Татарстан, их консервировали 2,5% раствором бихромата калия.

В условиях кафедры патологической анатомии и гистологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины» из проб фекалий телят изготавливали мазки, для чего применяли центрофужно-флотационный метод с применением раствора Бреза.

Для приготовления мазков применяли центрифугирование в сочетании с флотацией. Пробу фекалий массой 3 г помещали в стакан емкостью 50 мл, добавляли 15 мл воды, размешивали, фильтровали через металлическое сито, переливали в центрифужную пробирку и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 1-2 мин.

Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли раствора Бреза, перемешивали и снова центрифугировали в том же режиме. Затем металлической петлей снимали 3-5 капель с поверхностной пленки, и переносили на предметное стекло, делали тонкий мазок и высушивали на воздухе.

Раствор Бреза готовили по следующей прописи:

• 1.    Растворили в 1л горячей воды 1 кг сернокислой магнезии (Mg SO₄ * 7H 2 O).

• 2.    Растворили в 1 горячей воды 2 кг тиосульфата натрия (Na₂S₂O₃).

• 3.    Смешали 3 части первого раствора с 3 частями второго раствора, затем к этому раствору добавляли одну часть воды.

Нативные мазки, и мазки полученные с применением флотации, окрашивали по Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену, сафранином по Кестеру, а также применяли негативное окрашивание нигрозином.

Фиксация мазков. На высушенный мазок наносили несколько капель жидкость Никифорова и фиксировали в течение 10-15 минут до полного испарения спирт-эфира. Затем мазок окрашивали одним из следующих способов.

Окрашивание мазков по Циль-Нильсену . Зафиксированные мазки окрашивали в течение 20 мин красителем карболового фуксина, промывали водопроводной воде, слегка высушивали и наносили на стекло 10 % раствор серной кислоты на 60 секунд для обесцвечивания. В последующим промывали в водопроводной воде и докрашивали мазок 0,2% - ом водном растворе метиленового синего в течение 5 минут.

Окраска мазков сафранином по Кюстеру . Готовили отдельно 3% раствор сафранина и 5,6% раствор КОН в дистиллированной воде. Перед применением готовили рабочий раствор: смешивали 5 капель свежеприготовленного раствора сафранина и смешивали с 1,5 мл раствора КОН. Фиксированный мазок окрашивали раствором сафранина в течение 5 мин, промывали водопроводной водой, обесцвечивали 0,5% раствором серной кислоты в течение 15 секунд, промывали водой, докрашивали 5% раствором малахитового зеленого на 10% этиловом спирте в течение 10-15 секунд, промывали водой, высушивали на воздухе.

Для окрашивания по Романовскому — Гимзе готовили рабочий раствор краски из расчета 3 капли готовой краски на 1 мл воды (рН=7,0). На один препарат использовали 3-4 мл разведенной краски. Окрашивали фиксированные мазки в течение 20 мин, после чего их промывали водой и высушивали.

Негативное окрашивание нигрозином. На фиксированный мазок наносим 1% водного раствора нигрозина. Мазок тщательно высушивали на воздухе и исследовали под микроскопом.

Приготовленные мазки исследовали под микроскопом под увеличением 900-кратным увеличением под иммерсией.

Результаты исследования. При микроскопировании мазков полученных от проб фекалий привезенных из Сабинского района обнаружили ооцисты криспоридий размером 4,6-5,4 мкм, которые имели хорошо выраженную стенку. В мазках, изготовленных по Циль-Нильсену ооцисты окрашивались в цвет от красного до вишневого, окружающий фон был синий (фот № 1).

Фото №1.Ооцисты окрашенные по Циль-Нильсену

Фото № 2 Ооцисты окрашенные по Кестеру

В мазках, изготовленных по Романовскому-Гимзе, а также окрашенных нигрозином в поле зрения микроскопа были обнаружены единичные ооцисты криптоспоридий. При использовании метода Романовского-Гимзе ооцисты и вся микрофлора окрашивалась в синий цвет, что затрудняло диагностику инвазии. При применении негативного окрашивания с нигрозином, не было видно внутреннее содержимое ооцист.

В мазках, изготовленных по Кестеру, ооцисты криптоспоридий окрашивались в бледно-розовый цвет, и они хорошо выделялись на зеленом фоне. Другие микроорганизмы не окрашивались сафранином. Этот метод дал возможность увидеть также внутреннее содержимое ооцист – спорозоитов (фото №2).

Заключение. При диагностике криптоспоридиоза наилучшим является метод окрашивания сафранином по Кестеру. При использовании данного способа ооцисты криптоспоридий окрашиваются в бледнорозовый цвет, и они хорошо выделяются на зеленом фоне, а внутри ооцист различимы спорозоиты.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Акбаев М.Ш., Есаулова Н.В, Давыдова О.Е., Шемякова С.А., Шемяков Д.Н. / Диагностика криптоспоридиоза телят: Методические рекомендации // М.: ФГОУ ВПО «МГАВМиБ им. К.И. Скрябина», 2004. – 14 с. 2. Никитин В.Ф. / Криптоспоридиоз домашних животных // Издательство: ВИГИС. – 2007. – 36 с.

ЗНАЧЕНИЕ МЕТОДОВ ОКРАШИВАНИЯ ООЦИСТ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ КРИПТОСПОРИДИОЗА ТЕЛЯТ

Кириллов Е.Г., Латыпов Д.Г. Резюме

При диагностике криптоспоридиоза наилучшим является метод окрашивания сафранином по Кестеру. При использовании данного способа ооцисты криптоспоридий окрашиваются в бледно-розовый цвет, и они хорошо выделяются на зеленом фоне.

THE VALUE OF THE OOCYSTS STAINING METHOD WHEN DIAGNOSING THE CRYPTOSPORIDIOSIS IN CALVES

Kirillov Ye.G., Latypov D.G. Summary

In the diagnosis of cryptosporidiosis the method of staining with safranin by Koester is best one. When using this method oocysts of Cryptosporidium are painted in pale pink, and they are well seen against the green background.