Значение полиморфизмов генов факторов VII и XIII системы свертываемости крови в патогенезе нетравматического асептического некроза головки бедренной кости

Нетравматический асептический некроз (НАН) головки бедренной кости – заболевание, характерное для мужчин в возрасте от 20 до 50 лет; утрата трудоспособности молодыми людьми выводит данное заболевание в разряд социально значимых [1, 2].

Среди причин НАН головки бедренной кости выделяют длительное применение кортикостероидов, злоупотребление алкоголем, системную красную волчанку, серповидноклеточную анемию, болезнь Legg-Calve-Perthes, ионизирующую радиацию, цитотоксические

агенты и др. [3, 4]. Однако известно, что некроз головки бедренной кости может наблюдаться и при отсутствии вышеупомянутых факторов - так называемый «идиопатический».

Согласно данным литературы, в основе развития НАН лежат три основных механизма: механическое препятствие току крови, тромботическая окклюзия сосудов, экстраваскулярная компрессия [5]. Правомочно придается значение взаимодействию между генетической предрасположенностью к нарушениям гемоциркуляции и внешними факторами. У многих пациентов с НАН головки бедренной кости наблюдается сочетание неблагоприятных внешних факторов риска с наследственными: гиперкоагуляция, гемоглобинопатии, нарушения ангиогенеза, оксидативный стресс [6].

Возможно предположить, что определенную роль в патогенезе НАН играют некоторые наследственные особенности (полиморфизмы) генов факторов свертываемости крови. Как известно, система гемостаза представляет собой совокупность процессов, обеспечивающих жидкое состояние крови, поддержание ее нормальной вязкости, предупреждение и остановку кровотечений. В нее входят факторы свертывающей, естественной противосвертывающей и фибринолитической систем крови. В норме все процессы находятся в определенном балансе и обеспечивают жидкое состояние крови. Смещение равновесия вследствие внутренних или внешних факторов может повышать риск кровотечений и тромбообразования.

Особое внимание при оценке риска тромбоэмболий и инфарктов уделяется генам коагуляционных (свертывающих) факторов крови VII и XIII (F7, F13), изменения в которых в большинстве случаев направлены на обеспечение защитного эффекта. Снижение активности данных факторов способствует уменьшению тром-бообразования [7, 8].

Ген F7 кодирует фактор свертывания крови VII – витамин-К-зависимый профермент, продуцирующийся в печени. Основной физиологической ролью F7 является активация фактора свертывания крови Х. После повреждения сосуда F7 связывается с тканевым фактором III и переходит в активную форму. Эта реакция является основным событием в процессе свертывания крови [9]. Изменения в гене F7 в большинстве случаев имеют протективный эффект относительно риска развития тромбоэмболии. Замена гуанина (G) на аденин (А) в позиции 10976 (генетический маркер G10976A) приводит к изменению биохимических свойств фактора VII. Снижение активности F7 в результате замены способствует уменьшению тромбообразования. Генотип АА является причиной снижения активности фермента F7 на 72 % по сравнению с диким (наиболее часто встречающимся в популяции) – генотип GG [10]. Маркер ассоциирован со снижением вероятности инфаркта миокарда, даже при наличии ангиографически задокументированного, тяжелого коронарного атеросклероза. Гетерозиготы (носители одной аллели А и одного G, генотип AG) имеют риск заболевания инфарктом миокарда в 2 раза меньший, чем носители двух аллелей G (генотип GG) [11].

Фактор XIII (F13) представляет собой плазматический гликопротеин, циркулирующий в плазме крови в комплексе с белком фибриногеном. При активации системы свертывания крови F13 подвергается расщеплению ферментом тромбином (фактором свертывания крови II). Кофактором в данной реакции являются ионы кальция. Активированный белок F13a катализирует "сшивание" мономеров фибрина, образуя связи между аминокислотами, что ведет к формированию фибрина-полимера. Фибрин – основа сгустка крови, он стабилизирует тромб, завершая процесс свертывания крови [12]. Изменения в гене F13 в большинстве случаев снижают риск развития патологий, связанных с повышенным тромбообразованием. Участок, в котором происходит замена нуклеотида гуанина (G) на тимин (Т) в позиции 103, обозначается как генетический маркер G103T. В результате замены преобразуются биохимические свойства белка F13, а именно, его способность "сшивать" фибриновые мономеры, вследствие чего фибриновые сгустки получаются более тонкими [13]. При анализе частотности аллелей (G103T) у пациентов, перенесших инфаркт миокарда, и у контрольной группы был доказан защитный эффект присутствия в генотипе аллели Т [14].

Целью настоящего исследования явилось изучение вклада полиморфизмов генов факторов свертывания крови F7 и F13 в генез нетравматического асептического некроза головки бедренной кости.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В основу исследования легло предположение о важности генетических факторов в развитии некроза головки бедренной кости. В связи с этим нами были изучены полиморфизмы генов системы свертывания крови F7 и F13, роль которых известна в генезе развития ишемических расстройств различной локализации.

В процессе исследования проведен сравнительный анализ частоты встречаемости значимых аллельных вариантов генов F7 (Arg353Gln) и F13 (Val134Leu) у пациентов с верифицированным диагнозом НАН (основная группа) и у здоровых пациентов (контрольная группа).

Нами был обследован 41 больной (все – мужчины) с НАН головки бедренной кости. В данную группу вошли пациенты с неясной причиной заболевания, которое клинически манифестировало в возрасте от 27 до 45 лет. Критериями исключения являлись алкоголизм, длительный прием кортикостероидов, системные заболевания соединительной ткани, заболевания крови и прочие известные этиологические факторы НАН [15].

Стаж заболевания варьировал от 1 до 20 лет. На момент обследования у 24 из 41 пациента основной группы 1–10 лет назад было проведено одно-, двустороннее тотальное эндопротезирование тазобедренного сустава в связи со вторичным артрозом на фоне НАН 3–4 ст. Пятнадцать пациентов с НАН головки бедренной кости 3 ст. готовятся к аналогичной операции. Два пациента (НАН 3 ст.) получают консервативное лечение в связи с отказом от хирургического вмешательства.

При анализе семейного анамнеза пациентов с НАН головки бедренной кости отмечена высокая частота сердечнососудистых заболеваний (инсульт, инфаркт, острый тромбоз) у ближайших родственников (мать/ отец) – у 61 % (25 из 41) пациентов основной группы.

Следует подчеркнуть, что у 13 больных сердечнососудистые заболевания имели место у обоих родителей, причем у 6 – с летальным исходом.

При анализе соматического статуса у 12 пациентов основной группы установлена артериальная гипертензия 1–3 ст., у 6 – варикозная болезнь вен нижних конечностей, у 3 в анамнезе – острый тромбофлебит, потребовавший хирургического вмешательства, у 3 – коагулопатии (гиперфибриногенемии), требующие перманентной медикаментозной коррекции.

В контрольную группу вошло 320 мужчин аналогичной возрастной категории (25–45 лет) – военнослужащих, обследованных при профилактических осмотрах [16]. Ни у одного из пациентов контрольной группы не было выявлено клинических проявлений заболеваний тазобедренных суставов.

В программу обследования было включено исследование полиморфизмов генов Arg353Gln F7 и Val134Leu F13 методом ПЦР. Для генетического ис- следования выполнялась экстракция геномной ДНК на сорбенте из лимфоцитов периферической цельной крови при помощи коммерческого набора «ДНК-сорб-В» («АмплиСенс», Москва).

Определение аллельных вариантов генов проводили методом ПЦР в реальном времени на амплифика-торе ДТ-96 (производитель ДНК Технология, Россия) тест-системами для ПЦР - анализа (производитель ДНК Технология, Россия) согласно рекомендациям фирмы производителя.

При статистической обработке полученных данных было проведено сравнение результатов в основной и контрольной группах. Достоверность значений определялась в программе STATISTIСА при подсчете значения р по критерию χ ² Пирсона.

Все лица, включенные в исследование, дали письменное информированное согласие на участие в нем. Проведение исследования одобрено Этическим комитетом РУДН.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Нами были проанализированы частоты встречаемости аллелей А и G (в гомо- и гетерозиготном состоянии) гена Arg353Gln F7 у больных НАН и у здоровых людей. Как следует из таблицы 1, наличие аллели А было выявлено у 26,8 % пациентов основной группы, что в 3,5 раза ниже, чем в контрольной (у 97,1 %), различия статистически достоверны. Присутствие в генотипе аллели G отмечено у 73,2 % пациентов с НАН и у 22,8 % человек из контрольной группы, различия также статистически достоверны (табл. 1).

Таблица 1

Наличие аллелей А и G гена Arg353Gln F7 у пациентов двух групп

Наличие аллели	Основная группа (НАН, n = 41)	Контрольная группа (n = 320)	χ 2	р
А (генотипы АА+GA)	11/41 – 26,8 %	311/320 – 97,1 %	186,703	< 0,001
G (генотипы GG+GA)	30/41 – 73,2 %	73/320 – 22,8 %	45,199	< 0,001

Частота встречаемости аллелей гена Arg353Gln F7 в основной группе составила: GG – у 30 из 41 больного (73,2 %), GA – у 11 из 41 (26,8 %), причем полиморфный вариант АА не встретился ни у одного из 41 пациента. В контрольной группе частоты аллелей данного гена распределились следующим образом: GG – у 7 из 320 человек (2,2) %, GA – у 66 из 320 (20,6 %, AA – у 247 из 320 (77,2 %).

Достоверные различия были выявлены нами в частотах встречаемости гомозиготных генотипов – АА ( χ ² = 100,215, р < 0,001) и GG ( χ ² = 205,770, р < 0,001) в основной и контрольной группах (рис. 1). В отношении гетерозиготного генотипа GA различия были не достоверны – χ ² = 0,834, р = 0,362.

В дальнейшем нами были проанализированы частоты встречаемости различных аллельных вариантов гена Val134Leu F13.

Частота обнаружения аллели Т (генотипы TT+TG) у больных НАН составила 73,2 %, в контрольной группе – 90,0 %, различия статистически достоверны (р = 0,002). Различия в частоте встречаемости алле- ли G были еще более значимы: в основной группе – 90,2 %, в контрольной группе – 54,7 %; различия статистически достоверны – р < 0,001 (табл. 2).

Рис. 1. Частота встречаемости аллелей гена Arg353Gln F7 у пациентов с НАН головки бедренной кости и контрольной группы

Таблица 2

Наличие аллелей Т и G гена Val134Leu F13 у пациентов двух групп

Наличие аллели	Основная группа (НАН, n = 41)	Контрольная группа (n = 320)	χ 2	р
Т (генотипы ТТ+ТG)	30/41 – 73,2 %	288/320 – 90,0 %	9,810	0,002
G (генотипы GG+ТG)	37/41 – 90,2 %	175/320 – 54,7 %	18,956	< 0,001

Анализ частот встречаемости различных аллельных вариантов гена Val134Leu F13 показал, что в основной группе наличие гомозиготного генотипа ТТ отмечено у 4 из 41 пациента (9,8 %), гетерозиготного генотипа GT – у 26 из 41 (63,4 %), гомозиготного генотипа GG – у 11 из 41 (26,8 %). В контрольной группе частоты встречаемости аналогичных генотипов составили соответственно: 45,3 % (у 145 из 320), 45,0 % (у 144 из 320) и 9,7 % (у 31 из 320) (рис. 2).

Генотип GG в 2,8 раза чаще отмечен у пациентов основной группы, различия статистически достоверны (26,8 % против 9,7 %, χ ² = 10,388, р = 0,002).

Рис. 2. Частоты встречаемости аллельных вариантов гена Val134Leu F13 у пациентов основной и контрольной групп

С учетом данных литературы о протективной роли аллели Т в развитии ишемических расстройств нами были проанализированы частоты встречаемости данной аллели в исследуемых группах.

Наличие генотипа ТТ гена Val134Leu F13 почти в 5 раз чаще ( χ ² = 18,956, р < 0,001) выявлялось у здоровых людей (контрольная группа). Различия в частоте встречаемости аллели Т в гомо- и гетерозиготной комбинациях (ТТ и GT) в основной и контрольной группе оказались также статистически достоверными (72,7 % против 90,1 % соответственно, χ ² = 4,946, р = 0,027). Учитывая разницу в степенях достоверности (р < 0,001 против р = 0,027), можно заключить, что ключевую про-тективную роль в развитии асептического некроза головки бедра играет только гомозиготный генотип ТТ.

ДИСКУССИЯ

В результате исследования установлены возможные причины так называемого идиопатического некроза головки бедренной кости. Показано, что риск развития НАН повышен при определенных полиморфизмах генов факторов свертываемости крови F7 и F13.

Полученные нами данные позволяют предположить, что наличие аллели G гена Arg353Gln F7 может рассматриваться как один из факторов риска развития асептического некроза головки бедренной кости. Повышенная более чем в 30 раз (по сравнению с контрольной группой) частота встречаемости гомозиготного генотипа GG гена Arg353Gln F7 у больных асептическим некрозом головки бедренной кости, вероятно, свидетельствует о высокой значимости нарушений системы свертывания крови в генезе данного заболевания.

На универсальный характер ишемических расстройств в организме человека указывают результаты исследования M. Ramzia с соавт., которые выявили двукратное повышение риска инфаркта миокарда у носителей гомозиготной аллели GG гена Arg353Gln F7 [17].

В то же время нами установлено, что наличие аллели А гена Arg353Gln F7 в 3,5 раза чаще выявлялось в контрольной группе. Это указывает на ее протективную роль в отношении развития НАН. Известно, что генотип АА является причиной снижения активности фермента F7 на 72 % и ассоциирован со снижением вероятности инфаркта миокарда даже при наличии тяжелого коронарного атеросклероза. [10]. В отношении генотипа АА гена Arg353Gln F7 важно отметить, что его наличие не выявлено нами ни у одного из пациентов основной группы. В литературе есть указания на протективную роль данной аллели в отношении инфаркта миокарда и ишемического инсульта [11], что указывает на сходные элементы патогенеза «больших сосудистых катастроф» и НАН.

При анализе полиморфизмов гена Val134Leu F13 нами установлено, что аллельный полиморфизм GG можно рассматривать в качестве одного из факторов риска НАН: частоты встречаемости данного полиморфизма были достоверно различны в основной и контрольной группах ( χ ² = 10,388, р = 0,002). Литературных данных, указывающих на неблагоприятную прогностическую роль генотипа GG гена Val134Leu F13 в генезе ишемических расстройств, нами не обнаружено.

Генотип ТТ гена Val134Leu F13 почти в 5 раз чаще встречался у здоровых людей, чем у пациентов с НАН. Различия в частоте встречаемости аллели Т в гомо- и гетерозиготной комбинациях (ТТ и GT) в основной и контрольной группе оказались также статистически достоверными (72,7 % против 90,1 % соответственно, χ ² = 4,946, р = 0,027). Учитывая разницу в степенях достоверности (р < 0,001 против р = 0,027), можно заключить, что ключевую протективную роль в развитии асептического некроза головки бедра играет гомозиготный генотип ТТ. На низкую частоту встречаемости аллели T гена Val134Leu F13 в группе пациентов с инфарктом миокарда по сравнению с контрольной группой указывают Kreutz R. с соавт. [18], что подтверждает “коагулопатический” генез так называемого идиопатического некроза головки бедренной кости.

Гомозиготный генотип GG гена Val134Leu F13 в 2,8 раза чаще встречался у больных с НАН (26,8 % в основной группе против 9,7 % в контрольной, р = 0,002). Возможны различные варианты трактовки полученных данных. В связи относительно низкой (менее одной трети) частотой встречаемости генотипа GG в основной группе трудно утверждать, что наличие генотипа GG – самостоятельный фактор риска НАН; возможно, имеет значение не наличие генотипа GG, а отсутствие аллели Т в генотипе.

ВЫВОДЫ

Таким образом, проведенное нами исследование показало, что полиморфизмы генов факторов свертывания крови F7 и F13 вно сят существенный вклад в генез нетравматического асептического некроза головки бедренной кости. Показано, что фак- тором риска развития НАН является гомозиготный генотип GG гена Arg353Gln F7. Низкая вероятность заболевания НАН обусловлена протективной ролью генотипа АА гена Arg353Gln F7 и генотипа ТТ гена Val134Leu F13.

При выполнении данной работы конфликта интересов не было. Финансирование из внешних источников не привлекалось.