Адаптация Pseudomonas helmanticensis к додецилсульфату натрия в присутствии глицерина

Бактерии Pseudomonas продуцируют многие ценные вещества, в частности, полигид-роксиалканоаты (ПГА) – биоразлагаемые пластики, которые могут стать заменой традиционным полимерам, получаемым путем нефтехимического синтеза [1]. Основным недостатком ПГА, ограничивающим их широкое использование, является высокая стоимость их производства. Немалая часть всех затрат при получении ПГА обусловлена использованием паровой стерилизации сред, при которой расходуется большое количество энергии. Отказ от стерилизации позволил бы значительно снизить стоимость готового полимера. Неко- торые бактерии Pseudomonas, продуцирующие ПГА, обладают устойчивостью к высоким (до 5 г/л) концентрациям додецилсульфата натрия (SDS) – сильного ионного детергента, подавляющего рост большинства известных микроорганизмов [2]. Такие бактерии могут стать базой для разработки промышленных процессов синтеза ПГА, в которых культивирование проводится в присутствии SDS. Благодаря наличию в среде сильного детергента ингибируется рост посторонних микроорганизмов, но не продуцента ПГА, обладающего устойчивостью к SDS. Таким образом, использование SDS-содержащих сред позволяет отказаться от паровой стерилиза- ции. Одним из примеров устойчивых к SDS продуцентов ПГА является Pseudomonas hel-manticensis [2, 3].

Присутствие SDS в среде для культивирования вызывает у бактерий Pseudomonas значительный стресс [4]. Ответом на этот стресс служит активация трех различных механизмов. В частности, запускается процесс образования окруженных защитным матриксом агрегатов [3, 5, 6]. Кроме того, происходит снижение текучести мембранных липидов [3, 7]. Текучесть, оцениваемая как отношение содержаний ненасыщенных и насыщенных жирных кислот (ЖК), напрямую связана с проницаемостью билипидного слоя. Понижая текучесть (увеличивая долю насыщенных ЖК), клетка замедляет диффузию SDS в цитозоль [8]. Для расщепления поступающего из среды додецилсульфата бактерии Pseudomonas продуцируют ряд эндогенных сульфатаз [9, 10]. Для изучения механизмов устойчивости к алкилсульфатам применяют различные методы. Образование агрегатов можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии с предварительным окрашиванием культур универсальным красителем (например, Акридиновым оранжевым) [3]. Для изучения жирнокислотного состава липидов используют метод газовой хроматографии – масс-спектрометрии [11]. Активность эндогенных сульфатаз можно оценить по убыли концентрации SDS в среде в ходе культивирования.

Известно, что присутствие ряда легко расщепляемых субстратов (например, углеводов) ингибирует экспрессию сульфатаз, подавляя устойчивость бактерий Pseudomonas к SDS [12, 13]. Следовательно, использование сред сложного состава, содержащих помимо SDS какой-либо еще субстрат, сопряжено с рядом трудностей. Перед созданием неаксе-ничных процессов синтеза ПГА необходимо исследовать устойчивость продуцента к SDS в присутствии основного субстрата. Для получения ПГА часто используется глицерин, который образуется в процессе производства биотоплива [14]. Исследований влияния глицерина на устойчивость бактерий Pseudomonas к SDS не проводилось. Это побудило авторов статьи изучить влияние глицерина на различные механизмы устойчивости к SDS культуры P. helmanticensis – потенциального продуцента ПГА [2].

Объект исследований

Объектом исследований служила культура P. helmanticensis , выделенная из образца загрязненной почвы в Ленинградской области [3]. Культура хранится во ВНИИПД – Филиале «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН.

Влияние концентрации SDS на накопление биомассы при культивировании на среде, содержащей глицерин

Для определения максимальной концентрации SDS, при которой происходит накопление значительного количества биомассы, была поставлена серия экспериментов с варьированием содержания детергента в среде от 0,05 г/л до 5 г/л. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл на шейкере-инкубаторе при температуре 28 °С и скорости перемешивания 250 об/мин. Помимо SDS, среды содержали 10 г/л глицерина, 0,5 г/л NH 4 Cl, 0,5 г/л (NH 4 ) 2 SO 4 , 3 г/л Na 2 HPO 4 ·12H 2 O, 2 г/л KH 2 PO 4 ·H 2 O и 0,01 г/л MgSO₄. После завершения культивирования (96 ч) массу клеток отделяли центрифугированием (10 мин при 6800 × g), высушивали и взвешивали.

Культивирование P. helmanticensis для анализа устойчивости к SDS

Для изучения устойчивости к SDS P. hel-manticensis культивировали на среде, содержащей 0,5 г/л SDS, 10 г/л глицерина, 0,5 г/л NH 4 Cl, 0,5 г/л (NH 4 ) 2 SO 4 , 3 г/л Na 2 HPO 4 ·12H 2 O, 2 г/л KH 2 PO 4 ·H 2 O и 0,01 г/л MgSO 4 . Культивирование на аналогичной среде, не содержащей SDS, использовалось в качестве контроля. Образцы биомассы для анализа морфологии культур и жирнокислотного состава липидов отбирали после 96 ч культивирования. Степень деградации SDS анализировали также по окончании культивирования (по прошествии 96 ч).

Изучение морфологии культур методом эпифлуоресцентной микроскопии

Культуры клеток подвергали окрашиванию Акридиновым оранжевым по стандартному методу [3]. Для этого образцы культур наносили на предметное стекло и высушивали на воздухе. Затем стекло с клетками помещали в 0,001 % водный раствор красителя на 2 мин. После этого образец на 15 с последовательно помещали в дистиллированную воду, 50; 70 и 90 % раствор этанола в воде, на 15 с в чистый этанол и на 30 с в лимонен. Покров- ное стекло приклеивали с помощью Витроге-ля, и образец нагревали до 42 °С в течение 10 мин. Готовый образец исследовали при длине волны возбуждения 500 нм на микроскопе Leica DM 1000 LED («Leica», Германия).

Изучение жирнокислотного состава клеток P. helmanticensis

Анализ жирнокислотного состава проводили по стандартной методике [3]. К 70 мг биомассы добавляли 800 мкл смеси Фолча (хлороформ/метанол 2:1 по объему) и проводили экстракцию липидов в течение 12 ч при 4 °С. После этого смесь центрифугировали (10 мин при 6800 × g), органическую фазу отбирали и упаривали в токе азота при комнатной температуре. К сухому остатку добавляли 200 мкл метилирующей смеси – 2 % раствора серной кислоты в метаноле. Образцы нагревали до 65 °С в течение двух часов. По окончании реакции к смеси добавляли 200 мкл 4 % водного раствора карбоната натрия и проводили экстракцию 1 мл дихлорметана. Полученный экстракт анализировали методом ГХ/МС на хроматографе Varian 450-GC, снабженном масс-спектрометрическим детектором Varian 240-MS (колонка WCOT fused silica 50 m × 0.25 mm ID Coating CP-Wax 58 (FFAP-CB Df = 0.2)) («Varian», США). Объем вводимого в колонку образца составлял 1 мкл, газ-носитель – гелий, скорость потока 1 мл/мин. Хроматографическое разделение начинали при постоянной температуре (3 мин, 50 °С), затем температуру колонки линейно повышали до 250 °С в течение 20 минут. Завершали разделение при постоянной температуре (250 °С) в течение 40 минут. Отнесение сигналов производили путем сравнения их времен удерживания с хроматограммой стандартной смеси метиловых эфиров жирных кислот. Подтверждали отнесение с помощью сравнения масс-спектров отдельных компонентов смеси с базой данных. Каждый образец анализировали три раза. Доверительные интервалы результатов анализа рассчитывали с помощью критерия Стьюдента.

Анализ содержания SDS

Анализ содержания SDS в культуральной жидкости проводили спектрофотометрическим методом в соответствии с [15]. Для этого культуру клеток центрифугировали (6800 × g, 10 мин), а супернатант отделяли. 1 мл исследуемого раствора смешивали с 500 мкл раствора Метиленового синего (50 мг/л) в фосфатном буфере (0,0007 моль/л, pH = 7,2) и

3 мл хлороформа. Проводили экстракцию в течение 3 мин, органический слой отделяли и измеряли его оптическую плотность при 655 нм (кювета толщиной 1 см) на фоне холостого раствора. Определение осуществляли с помощью градировочного графика.

Результаты и их обсуждение

Влияние концентрации SDS на накопление биомассы при культивировании на среде, содержащей глицерин

Зависимость выхода биомассы от начальной концентрации SDS при культивировании P. helmanticensis на средах, содержащих глицерин, представлена на рис. 1. Заметный рост биомассы (3,2 г/л) наблюдается при концентрации SDS 0,5 г/л и менее. В присутствии глюкозы сопоставимые количества биомассы P. helmanticensis образуются только при концентрации SDS не более 50 мг/л [3]. Таким образом, устойчивость P. helmanticensis при наличии глицерина в среде для культивирования в 10 раз выше, чем в случае глюкозы. По всей видимости, эта разница обусловлена подавлением экспрессии сульфатаз: в присутствии глюкозы это ингибирование на порядок сильнее, чем в случае глицерина. Анализ культуральной жидкости на наличие SDS также подтверждает предположение об эффективной экспрессии сульфатаз в присутствии глицерина: в конце культивирования содержание SDS в среде было ниже предела чувствительности используемого метода. Можно сделать вывод, что один из основных механизмов устойчивости к алкилсульфатам – выработка расщепляющих SDS ферментов – не подавляется глицерином.

Рис. 1. Зависимость выхода биомассы

P. helmanticensis от начальной концентрации SDS. Основной источник углерода – глицерин (10 г/л)

Образование агрегатов

При культивировании в присутствии SDS P. helmanticensis образует клеточные агрегаты (рис. 2 А). Напротив, клетки P. helmanticensis в контрольном образце, не содержащем SDS, находились в планктонной форме (рис. 2 Б). Таким образом, важнейший механизм устойчивости к SDS – образование окруженных защитным матриксом агрегатов – активируется независимо от наличия глицерина в среде.

Влияние SDS на жирнокислотный состав P. helmanticensis

Содержание насыщенных ЖК (C[14: 0] и C[16: 0]) значительно выше в образцах клеток, полученных культивированием в присутствии SDS (см. таблицу). Текучесть мембранных липидов, определяемая соотношением между ненасыщенными и насыщенны- ми жирными кислотами, в 2,5 раза выше, если в среде для культивирования отсутствует детергент. Наличие SDS активирует пери-плазматические гидрогеназы ЖК [16]. В результате возрастает доля липидов, содержащих насыщенные ЖК, и имеющих меньшую текучесть, а значит и проницаемость. Таким образом клетка замедляет диффузию детергента в цитозоль, снижая его токсическое действие [3].

Выводы

ПГА-продуцирующая культура P. helman-ticensis способна адаптироваться к средам, содержащим до 0,5 г/л додецилсульфата натрия в присутствии глицерина. Показано, что адаптация обеспечивается активацией трех защитных механизмов: образование окруженных матриксом агрегатов, модификация мем-

Рис. 2. Культуры клеток P. helmanticensis , выращенные в присутствии SDS (А) и на чистом глицерине (Б)

Результаты анализа жирнокислотного состава биомассы P. helmanticensis

Среда	10 г/л глицерин	10 г/л глицерин + 0,5 г/л SDS
C[14: 0] (0,2)	1,2	3,9
C[16: 0] (0,3)	35,1	55,1
цис-9-C[16: 1] (0,2)	31,9	18,7
цис-10-C[17: 1] (0,1)	3,4	4,0
цис-9-C[18: 1] (0,2)	28,4	18,3
Ненасыщ/насыщ (0,02)	1,75	0,69

Примечание: Доверительные интервалы результатов анализа (p < 0,05), вычисленные с помощью критерия Стьюдента, приведены в скобках.

бранных липидов и синтез ферментов, расщепляющих алкилсульфаты. Относительно высокая предельная концентрация додецилсуль- фата (0,5 г/л) позволяет использовать P. helmanticensis для создания процессов биоконверсии глицерина в ПГА без предварительной стерилизации сред.