Использование метода ОТ-ПЦР для выявления генома вируса болезни Акабане в органах и крови экспериментально зараженных морских свинок
Автор: Никитина Е.Г., Сальников Н.И., Каторкин С.А., Балашова Е.А., Цыбанов С.Ж., Колбасов Д.В., Луницин А.В.
Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology
Рубрика: Микробиология, вирусология, молекулярная биология
Статья в выпуске: 6 т.49, 2014 года.
Бесплатный доступ
Болезнь Акабане - трансмиссивная арбовирусная инфекция крупного и мелкого рогатого скота, вызываемая вирусом серогруппы Simbu семейства Bunyaviridae. Болезнь наносит большой экономический ущерб, причиняемый животноводческой отрасли в результате эпизоотий, поскольку при заболевании происходят прямые потери от гибели животных, снижения продуктивности домашних жвачных животных и нарушения воспроизводительной функции у больных животных. Болезнь протекает в виде эпизоотии, характеризуется географической приуроченностью, выраженной сезонностью (август-октябрь, февраль) и периодичностью возникновения с интервалом в несколько лет. Для накопления вируса Акабане обычно используют 1-2-суточных белых мышей-сосунов, которые представляют собой наиболее чувствительную систему для изоляции всех буньявирусов. Ранее во Всероссийском НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВиМ) была разработана тест-система для выявления РНК вируса болезни Акабане на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени и подтверждена ее эффективность при обнаружении вируса у экспериментально зараженных мышей и в инфицированных культурах клеток. Однако представляло интерес, с одной стороны, оценить возможности предложенной тест-системы при расширении круга исследуемых объектов, с другой - найти новые модели для изучения и накопления вируса. В настоящей работе мы использовали здоровых морских свинок ( n = 20, масса каждая особи - по 400 г). Эксперимент по заражению морских свинок проводили в трех повторностях. Животных заражали концентрированным культуральным материалом, содержащим вирус болезни Акабане (штамм В8935) с инфекционной активностью 7,0 lg ТЦД 50/см 3. Начиная со 2-х по 6-е сут после заражения, у всех животных ежедневно отбирали пробы крови. В пробах крови от всех морских свинок геном вируса болезни Акабане был обнаружен только на 4-е сут после заражения. Одна особь пала на 1-е сут после заражения (возможно, вследствие неспецифической реакции, так как выявить геном вируса болезни Акабане при исследовании образцов органов, взятых post mortem у этого животного, не удалось). Дополнительно для получения биоматериала на 4-е сут после заражения у нескольких морских свинок были отобраны органы (мозг, легкое, почки, лимфоузел, сердце), в тканях которых также обнаружили вирус Акабане. Этим подтверждается эффективность разработанной тест-системы при диагностике вируса болезни Акабане и возможность использовать для его накопления еще один модельный объект - морских свинок.
Болезнь акабане, вирус болезни акабане, морские свинки, комары culicoides, от-пцр, тест-система
Короткий адрес: https://sciup.org/142133556
IDR: 142133556 | УДК: 636.2/.3:619:578:57.083 | DOI: 10.15389/agrobiology.2014.6.67rus
Detection of Akabane virus genome in organs and blood of experimentally infected cavies
Akabane disease, a transmissible pathology of cattle, sheep and goats, is caused by Simbu serotype virus ( Bunyaviridae ) and results in significant economical losses due to abortions, unviable and abnormal calves, or dead embryos and calves born. The Akabane disease epizooties, characterized by geographic locations and the coincidence with definite seasons, are widely registered. For preparative accumulation of Akabane virus the 1-2 day mice are used as the most sensitive system for Bunyaviridae isolation. Earlier we reported the development of a test system for Akabane virus RNA indication by real time reverse transcription PCR. Its efficacy was approved using infected mice and cell cultures. Furthermore, it was of interest to estimate this test system with respect to more wide range of model animals to be involved in the study and reproduction of Akabane virus. In this investigation, healthy cavies ( n = 20, the animal weight of 400 g) were infected with a concentrated viral culture (B8935 strain) of 7.0 lg lg TCID 50/cm 3. In blood the Akabane virus RNA was detected in four animals only 4 days after inoculation, but not shown in the rest probes, which were sampled from 2 to 6 days, and one cavy died a day after infection, probably due to nonspecific reaction as the Akabane virus genome was not detected in the post mortem tissue samples of all the organs of the animal tested. After 4 days the Akabane virus RNA was also indicated in brain, lung, kidney, hart and lymphatic gland. Thus, the developed test-system is effective for Akabane disease diagnosis, and the experimentally infected cavies can be the model animals used to study and produce Akabane virus preparations.
Текст научной статьи Использование метода ОТ-ПЦР для выявления генома вируса болезни Акабане в органах и крови экспериментально зараженных морских свинок
Болезнь Акабане — трансмиссивная арбовирусная инфекция крупного и мелкого рогатого скота, вызываемая вирусом серогруппы Simbu семейства Bunyaviridae. Болезнь наносит большой экономический ущерб, причиняемый животноводческой отрасли в результате эпизоотий, поскольку при заболевании происходят прямые потери от гибели животных, снижения продуктивности домашних жвачных животных и нарушения воспроизводительной функции у больных особей (1-3). Ареал этого заболевания установлен не окончательно. С 1959 года его регистрируют в Японии, с 1972 года — в Австралии и Новом Южном Уэльсе, c 1969-1970 годов — в Израиле, Корее и Кении (4, 5). Болезнь протекает в виде эпизоотии, характеризуется географической приуроченностью, выраженной сезонностью (август—октябрь, февраль) и периодичностью возникновения с интервалом в несколько лет (1, 2, 6). Вирус переносится кровососущими насекомыми, обычно мелкими комарами рода Culicoides: в Африке — Culicoides milne и Culicoides imicola, в Японии — Culicoides oxystoma, в Австралии — Culicoides brevitarsis и Culicoides wadei. Также вирус выделяли от москитов Aedes vexans и Culex triaeniorhynchus в Японии (6, 7) и Anopheles fenestus в Кении (2-4, 8-10).
В настоящее время актуальность проблемы этой инфекции возрастает. В специальной литературе в последние годы представлены работы по выявлению распространения вируса в разных странах (11-13), изучению его генетических свойств и патогенности (14). В ряде лабораторий выполняются серологические и иммунологические исследования (15, 16), имеются также сообщения о разработках вакцин (17, 18). В этой связи специальное внимание уделяется методам диагностики и индикации вируса (19, 20).
Для диагностики болезни Акабане используют метод флюоресцирующих антител, реакции нейтрализации, задержки гемагглютинации, связывания комплемента, диффузионной преципитации, твердофазный им-муноферментный анализ. Материалом для выделения вируса болезни Акабане служат пробы различных органов и тканей от плодов абортировавших животных (мозг, лимфоузлы, селезенка, почки, скелетные мышцы, плацента, кровь) и кровь больных животных (2, 21).
Для выделения вируса Акабане обычно используют 1-2-суточных сосунков белых мышей, которые представляют собой наиболее чувствительную систему для изоляции всех буньявирусов (21).
Разработанная нами тест-система для обнаружения генома вируса болезни Акабане на основе ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени позволяет выявлять геном вируса болезни Акабане в пробах мозга экспериментально зараженных мышей и в инфицированных культурах клеток (22, 23).
Нашей целью было изучение возможности выявления РНК вируса болезни Акабане в крови экспериментально зараженных морских свинок с использованием предложенной тест-системы и получение проб органов от инфицированных особей для дальнейших исследований.
Методика . Для получения культурального вируссодержащего материала проводили заражение культуры клеток CV-1 вирусом болезни Акабане (штамм В8935). Инфицированную культуру инкубировали в стационарных условиях при 37±0,5 ° C в течение 2-3 сут. Титрование вируса проводили в лунках полистироловых пластин с монослойной культурой клеток CV-1. Наблюдение вели в течение 7 сут. Результаты титрования учитывали по цитопатогенному действию (ЦПД).
Здоровых морских свинок (масса каждой по 400 г) заражали концентрированным культуральным материалом, содержащим вирус болезни Акабане (штамм В8935) с инфекционной активностью 7,0 lg ТЦД50/см3. Эксперимент по заражению морских свинок проводили в трех повторностях. Всех морских свинок разделили на две группы. Морским свинкам из I группы вводили культуральный вируссодержащий материал в объеме 50 мкл, при инфицировании особей из II группы дозу увеличивали 10кратно (500 мкл).
Начиная со 2-х по 6-е сут после заражения, у всех животных ежедневно отбирали пробы крови и исследовали с использованием «Тест-системы для выявления РНК вируса болезни Акабане методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» (3, 22, 23). Дополнительно с целью получения биоматериала для дальнейшей научно-исследовательской работы на 4-е сут после заражения у морских свинок из II группы были взяты пробы органов (мозга, легкого, почек, лимфоузла, сердца).
Вирусную РНК из биологического материала выделяли методом нуклеосорбции с использованием набора TRIzol LS Reagent («Invitrogen, Inc.», США) согласно рекомендациям производителя (23, 24).
Постановку ОТ-ПЦР осуществляли в амплификаторе Rotor Gene 6000 («Corbett Research», Австралия) в соответствии с инструкцией к тест-системе (3, 22, 23).
Результаты . Вирус болезни Акабане размножается на куриных эмбрионах и на мышах-сосунах (при внутримозговом заражении у них через 2-3 сут развиваются параличи). К возбудителю чувствительны также перевиваемые клеточные линии различного происхождения — ВНК-21, VERO, HmLu-1 с выраженным ЦПД через 48-72 ч.
Поскольку одной из задач работы было получение проб биоматериала от лабораторных животных для дальнейшего использования в научных исследованиях, в качестве экспериментальных объектов были выбраны именно морские свинки. По живой массе и массе внутренних органов они значительно превосходят лабораторных крыс и мышей, следовательно, для получения определенного количества биоматериала необходимо минимальное число животных.
Предложенная и примененная в настоящем исследовании тест-система основана на детекции продуктов амплификации в режиме реального времени с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров AV d и AV u, фланкирующих фрагмент размером 113 п.н., который комплементарен последовательности гена нуклеокапсидного белка N и зонда AV z, комплементарного внутреннему фрагменту выбранного участка (технология TaqMan). Эта тест-система обладает высокой чувствительностью: при исследовании тканей и органов соответствующий показатель составил 1,5±0,5 lg МЛД50/см3, при анализе культурального материала — 1,0±0,5 lg ТЦД 50 /см3.
В пробах крови от всех морских свинок геном вируса болезни Акабане обнаруживался только на 4-е сут после заражения. Полученные результаты представлены в таблице. Гибель одной особи из II группы, зарегистрированная уже на 1-е сут после заражения, возможно, была обусловлена неспецифической реакцией, так как нам не удалось выявить геном вируса болезни Акабане при исследовании образцов органов, взятых post mortem у этого животного.
Результаты выявления генома вируса болезни Акабане в крови экспериментально зараженных морских свинок с использованием разработанной тест-системы на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени
Срок после Группа экспериментальных животных заражения, сут I (n = 12) | II (n = 8)
2-е --
3-и --
4-е ++
5-е --
6-е --
Примечание. «+» и « - » — соответственно выявление генома вируса в образцах и отрицательный результат тестирования.
В качестве примера на рисунке 1 представлены результаты амплификации образцов нуклеиновых кислот, выделенных из крови морских свинок в одном из проведенных экспериментов.
При исследовании тканей мозга, легких, почек, лимфоузла, сердца, взятых у животных из II группы, РНК вируса болезни Акабане обнаружили во всех исследуемых образцах. В качестве примера на рисунке 2 представлены типичные результаты амплификации нуклеиновых кислот, выделенных из внутренних органов морских свинок.
Рис. 1. Графики накопления флуоресцентного сигнала при выявлении генома вируса болезни Акабане в крови морских свинок с использованием разработанной тест-системы на основе ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени: 1 — рекомбинантный положительный контроль амплификации; 2-5 — образцы от инфицированных животных (соответственно №№ 1-4); 6 — отрицательный контроль выделения; 7 — отрицательный контроль ПЦР (4-е сут после экспериментального заражения; приведены результаты типичного опыта).
Рис. 2. Графики накопления флуоресцентного сигнала при выявлении генома вируса болезни Акабане в тканях внутренних органов у морской свинки № 4 с использованием разработанной тест-системы на основе ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени: 1 — мозг; 2 — легкие; 3 — почка; 4 — лимфоузел; 5 — сердце; 6 — отрицательный контроль выделения; 7 — отрицательный контроль ПЦР; 8 — положительный контроль (4-е сут после экспериментального заражения).
Таким образом, с использованием тест-системы на основе ОТ-ПЦР в реальном времени, разработанной во Всероссийском НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, РНК вируса болезни Акабане была выявлена в образцах органов и крови экспериментально зараженных морских свинок. Следовательно, животные этого вида могут быть использованы при валидации и апробации подобных тест-систем.
