Распространение и генетическая вариабельность вируса гепатита Е на птицефабриках в странах бывшего СССР

В настоящее время гепатит Е зарегистрирован у кур во многих странах мира — в Австралии (1), США (2), Испании (3), Венгрии (4), России (5) и др. Возбудителем заболевания служит вирус гепатита Е (ВГЕ) рода Hepevirus , семейства Hepeviridae . Это безоболочечный вирус, геном которого представлен одноцепочечной РНК с положительной полярностью (6). Геном ВГЕ имеет длину около 6600 п.н. и содержит три открытые рамки считывания (open reading frame, ORF) (7). ORF1, расположенная на 5'-конце генома, кодирует неструктурный полипротеин с доменами, которые соответствуют вирусной метилтрансферазе, папаин-подобной протеазе, вирусной хеликазе и РНК-зависимой РНК-полимеразе (8), ORF2 и ORF3 — соответственно капсидный белок и фосфопротеин (9-11).

Вирус гепатита Е представляет серьезную угрозу птицеводческим хозяйствам, вызывая у кур поражения печени, а также органов иммунной системы — селезенки и тимуса. Патология может проявляться в форме, получившей название болезни большой печени и селезенки (big liver and spleen disease, BLS) и как синдром гепатит-спленомегалии (hepatit-spleno-megaly syndrome, HSS). Установлено, что при вирусном гепатите Е происходят глубокие нарушения гомеостаза, и в частности гематологических показателей (12).

В 2004 году при исследовании сывороток крови кур из Свердловской области антитела к ВГЕ были обнаружены у 18,3 % обследованной птицы, что свидетельствует о циркуляции вируса на указанной территории (13). Первое сообщение о генетической идентификации ВГЕ у кур в Российской Федерации было сделано в 2009 году (5). Однако до настоящего времени эпизоотическая обстановка по вирусному гепатиту Е у кур оставалась малоизученной.

Целью нашей работы было исследование на наличие вируса гепатита Е в птицеводческих хозяйствах, а также оценка генетической вариабельности изолятов на основе фрагмента гена капсидного белка.

Методика . В работе использовали 415 образцов печени, которые были получены за период с 2009 по 2012 год от разновозрастных кур-несушек и бройлеров (кроссы Родонит 3, Ross 308, Hubbard ISA) из 68 птицеводческих хозяйств, представляющих 36 регионов России, и 4 хозяйств из стран бывшего СССР (Республика Беларусь, Казахстан и Украина).

Для получения РНК использовали набор для выделения нуклеиновых кислот РИБО-сорб (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия, г. Москва) в соответствии с инструкцией производителя. Набор включает в себя лизирующий, отмывочный и элюирующий буферы, а также силикатный сорбент. При постановке ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) применяли праймеры и условия проведения реакции, предложенные Z.F. Sun с соавт. (14), с некоторыми модификациями.

Нуклеотидные последовательности во фрагменте гена капсидного белка длиной 242 н. определяли с помощью автоматического секвенатора ABI Prism 3130 («Applied Biosystems», США). Анализ последовательностей выполняли с использованием алгоритма ClustalW (программа BioEdit v. 7.0.5.3). При построении дендрограмм применяли метод Neighbor-joining c бутстрэп-анализом ( n = 1000) (программа MEGA v. 3.1). Для сравнения служили последовательности ВГЕ кур из международной базы данных GenBank (номера последовательностей FM872312-FM872320, FM872322-FM872330, FN557166-FN557172, AM943646). Внешняя референтная группа при построении дендрограммы была представлена последовательностью капсидного белка ВГЕ свиней.

Результаты . Исследование биологического материала. С помощью ОТ-ПЦР (14) при анализе образцов, полученных как от кур с признаками поражения печени, так и от клинически здоровых особей (без снижения яйценоскости и повышенной смертности), выявили 14 изолятов ВГЕ (табл.).

Характеристика изолятов вируса гепатита Е, выделенных при обследовании птицеводческих хозяйств из стран бывшего СССР (2009-2012 годы)

Изолят	Страна и регион выявления	Год отбора пробы	Клинические признаки	Кросс	Возраст, сут	Номер последовательности в GenBank
aHEV16050	Казахстан, н.д.	2009	Увеличение печени Родонит 3		ОП	JQ814691
aHEV16211	РФ, Вологодская область	2010	Увеличение печени и селезенки, геморрагические поражения печени	Ross 308	230	JQ814690
aHEV16279	РФ, Калужская область	2011	Увеличение печени Ross 308		237	JQ814692
aHEV18196	РФ, Ивановская область	2012	Отсутствуют	Ross 308	117, 350	JQ814688
aHEV18198	РФ, Саратовская область	2012	Отсутствуют	Hubbard ISA	315	JQ814689
aHEV18381	РФ, Московская область	2012	Отсутствуют	Н.д.	Н.д.	-
aHEV18383	РФ, Амурская область	2012	Отсутствуют	Hubbard ISA	30-36	-
aHEV18479	РФ, Вологодская область	2012	Увеличение печени
			и селезенки	Ross 308	193	-
aHEV18481	РФ, Вологодская область	2012	Увеличение печени
			и селезенки	Ross 308	250	-

Продолжение таблицы

aHEV18505	РФ, н.д.	2012	Отсутствуют	Н.д.	Н.д.
aHEV19551	РФ, Республика Марий Эл	2012	Отсутствуют	Ross 308	241
aHEV19553	РФ, Республика Марий Эл	2012	Отсутствуют	Ross 308	394
aHEV19555	РФ, Саратовская область	2012	Отсутствуют	Hubbard ISA	306
aHEV20088	РФ, Саратовская область	2012	Отсутствуют	Ross 308	224

Примечание. ОП — общая проба от кур различных возрастных групп, н.д. — нет данных; прочерки означают, что последовательности не зарегистрированы в GenBank.

На карте (рис. 1) отмечены регионы, в которых выявили вирус гепатита Е у кур.

Рис. 1. Распространение вируса гепатита Е у кур в птицеводческих хозяйствах на территории Российской Федерации: 1 — Амурская область, 2 — Вологодская область, 3 — Ивановская область, 4 — Калужская область, 5 — Республика Марий Эл, 6 — Московская область, 7 — Самарская область, 8 — Саратовская область; темно-серым цветом отмечены регионы, где вирус не выявлен, светло серым — регионы, в которых обследования не проводили (2009-2012 годы).

Филогенетический анализ. В результате молекулярно-биологических исследований были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена капсидного белка у 14 полученных изолятов ВГЕ и проведен их филогенетический анализ (рис. 2).

По данным литературы, известные штаммы и изоляты ВГЕ разделяют на три основных генотипа: австралийский (генотип 1), американский (генотип 2) и европейский (генотип 3) (15, 16). Кроме того, выделяют потенциальный самостоятельный генотип, представленный на дендрограмме изолятом HU-16773 из Венгрии.

Российские изоляты aHEV18198, aHEV19555, aHEV16211, aHEV18479 и aHEV18481 можно отнести к европейскому генотипу 3 (см. рис. 2). Три из них (aHEV16211, aHEV18479, aHEV18481) оказались генетически близки к вирусам из Китая (China-09-G57 и др.), США (NY449, CA697A) и Европы (06-4582 и др.) этого генотипа. Изоляты aHEV18198 и aHEV19555, как следует из полученной дендрограммы, были родственны с образцами из Австралии и Канады (05-6745-2, Guelph01). Сходство между указанными российскими изолятами и другими представителями генотипа 3 достигало 84,0-97,6 %.

Семь из 14 выявленных в результате нашего обследования изолятов (aHEV16050, aHEV19553, aHEV19551, aHEV18196, aHEV16279, aHEV20088, aHEV18383) значительно отличались от других известных штаммов и изолятов вируса и формировали отдельную генетическую линию (см. рис. 2). Степень сходства этих изолятов между собой составляла 89,6-99,2 %, тогда как с остальными штаммами и изолятами ВГЕ кур — 76,0-87,2 %.

Изоляты aHEV18505 и aHEV18381 не входили ни в одну из описанных генетических групп. Их сходство между собой и с остальными штаммами и изолятами ВГЕ кур характеризовалось значениями соответственно 83,2 и 76,8-84,8 %.

HU-16773

CA518.5

CA708A

CA518.3

07-861

	85
	C d
75

NY449

China-09-A5

China-09-Z56

94 CA697B

Guelph01

Guelph02

CA242

aHEV19555

⁹⁵    aHEV18198

-09-B3

-09-G57

Генотип 3

CA697C

CA077

05-3006-6

07-2079

06-5540

07-1396

aHEV18479

⁹²    aHEV16211

aHEV18481

06-4582

06-613

05-5117

06-4806

07-9910

07-10225

99 05-6745-2

05-6744-1

05-6744-3

05-6744-2

Генотип 1

05-6744-4

05-2294

94     aHEV16050

aHEV19553 aHEV19551

aHEV18196 aHEV16279 aHEV20088

aHEV18383

CA889

aHEVSP-291

84 aHEVSP-46

aHEVSP-252

aHEVSP-417

WI966G

WI966B

WI318B

2553-27F

2553-28S

2553-27S

Генотип 2

2553-26S

2553-28F

2553-26F aHEV18381

aHEV18505

Вирус гепатита Е свиней

।----------------------------1

0,05

Рис. 2. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей во фрагменте гена капсидного белка у изолятов вируса куриного гепатита Е (aHEV) разного происхождения (бутсрэп- значения > 75 %; изоляты aHEV, выявленные при обследовании птицеводческих хозяйств из Российской Федерации, Республики Беларусь, Казахстана и Украины в 2009-2012 годах, отмечены черными кружками; подробное описание см. в тексте).

Следует отметить, что современное российское промышленное птицеводство имеет тесные торговые отношения со многими странами по импорту инкубационных яиц и суточного молодняка для комплектования поголовья родительских стад бройлеров и цыплят яичного направления. В связи с широким распространением вируса гепатита Е кур в Австралии (1), США (2), Испании (3), Венгрии (4), Корее, Чехии, Англии, Украине, Польше, Израиле (16) и Китае существует объективная необходимость оценки эпизоотической ситуации и в России. Увеличение печени и селезенки, подкапсульные гематомы, разрыв печени и кровоизлияния в брюшную полость, снижение яичной продуктивности и повышение смертности встречаются в птицеводческих хозяйствах России, однако этиологическая роль вируса гепатита Е кур была идентифицирована только недавно (5).

Важно подчеркнуть, что при обследовании вирус был выявлен как у кур с признаками поражения печени, так и у клинически здоровых особей (см. табл.), и это согласуется с данными других исследователей (3, 14, 16, 17). Так, X.J. Meng с соавт. (17) показали, что в большинстве случаев инфекции, вызванные ВГЕ, протекают субклинически. В нашем исследовании основную часть изолятов (9 шт.) выявили у клинически здоровых особей. Имеются данные, которые свидетельствуют о том, что проявление клинических признаков у кур при инфицировании ВГЕ может зависеть от дозы вируса, присутствия ассоциированных патогенов, возраста инфицирования, породы кур и штамма вируса, а также вакцинации (3, 7, 16). Можно предположить, что куры с признаками поражения печени могли быть инфицированы высокой дозой вируса при действии неизвестных стресс-факторов. Однако ассоциированные агенты, вызывающие сходные проявления (вирус лейкоза, вирус болезни Марека, аденовирусы), нами выявлены не были (данные не представлены). Все исследованные пробы получены от кур старше 200 сут. Необходимо также отметить, что среди обследованной птицы наиболее часто вирус детектировали у кур кросса Ross 308 (8 изолятов из 14).

По сходству нуклеотидной последовательности гена капсидного белка (ORF2) 7 из 14 российских изолятов ВГЕ сформировали генетическую группу с примыкающей к ней линией из еще двух изолятов (см. рис. 2). Подчеркнем, что полученные ранее другими учеными данные по филогенетическому анализу вируса гепатита Е кур свидетельствовали о существовании трех генотипов вируса в соответствии с географическим регионом выделения (Австралия, США и Европа) (15, 16) и возможном новом генотипе из Венгрии. Не исключено, что группа из российских изолятов (см. рис. 1) также будет представлять новый генотип, однако для подтверждения или опровержения такого вывода необходимо провести полное секвенирование вирусного генома.

Z.F. Sun с соавт. (14) сообщили о 76-100 % подобия изолятов вируса куриного гепатита Е, выявленных на территории США, при этом степень их сходства с вирусами свиньи и человека составляла 48-54 %. В результате исследований I. Bilic с соавт. (15) было установлено сходство для фрагмента гена капсидного белка у изолятов вируса из разных стран Европы (84-100 %), а также из Австралии (85,1-99,4 %). Для вирусов из Европы и Австралии степень сходства изолятов варьировала в пределах 80,6-85,7 %, из Европы и США — в пределах 76,6-82,9 %, из Австралии и США — в пределах 76,0-80,6 %.

Для трех изолятов (aHEV16211, aHEV18479 и aHEV18481) из группы, представляющей европейский генотип 3, наиболее близким был изо-лят 06-4582 из Австрии (см. рис. 2). Два других изолята, aHEV18198 и aHEV19555, относящиеся также к европейскому генотипу 3, располагались ближе к изолятам из Австралии и США (Guelph01, CA518.3). Степень гомологии между перечисленными пятью российскими изолятами и другими представителями генотипа 3 достигала 85,6-96,8 % (см. рис. 2) (напомним, что остальные девять российских изолятов с известными в настоящее время генотипами не группировались). Таким образом, на территории РФ циркулируют изоляты вируса гепатита Е, относящиеся к европейскому генотипу 3, и ВГЕ из российской группы, которая пока не отнесена ни к одному из генотипов. Полученные нами результаты подтверждают имеющиеся данные о высокой генетической гетерогенности вируса гепатита Е у кур, штаммы которого циркулирут во всем мире (14, 15).

Анализ вариабельности изолятов ВГЕ из разных стран показывает, что историческое разделение на генотипы по географическому признаку сейчас необходимо пересмотреть (15, 16). Например, Корея расположена далеко от Австралии, однако корейские изоляты входят в группу австралийского генотипа (18). Аналогичная ситуация наблюдается и для изолятов ВГЕ из Европы и Китая. Для объяснения возможных причин такой генетической близости в географически разделенных регионах мира необходим анализ большего числа вирусных образцов.

Впервые о случаях сероконверсии к вирусу гепатита Е в России сообщил Ибрахим Ел-Морси в 2004 году (13) на основании обследования поголовья кур в Екатеринбурге, в результате которого у 18,3 % особей были обнаружены антитела к ВГЕ. Однако эти данные лишь косвенно указывали на циркуляцию вируса среди птицы, а выполненные исследования не могут считаться системными. В других странах анализ серопревалентности по ВГЕ свидетельствует о достаточно широком распространении вируса (1, 19). Так, в Корее она регистрируется у 57 % поголовья кур (18). В США при исследовании 1276 сывороток крови в 76 стадах кур у 71 % особей отмечали сероконверсию (7). Та же группа ученых показала, что у кур старше 18 нед серопревалентность выше, чем у молодняка (7). В нашем исследовании все куры, у которых ПЦР-пробы были положительными по ВГЕ, оказались серопозитивными (данные не представлены). Более того, анализ сыворотки крови кур с отрицательными ОТ-ПЦР-пробами также выявил наличие антител. Иными словами, даже в отсутствие системных исследований можно предположить, что вирус гепатита Е очень широко распространен среди поголовья птицы.

Согласно наблюдениям P. Billam с соавт. (20), при естественном заражении куры инфицируются примерно на 12-й нед жизни, а виремия регистрируется с 14-й до 17-й нед. В их исследовании у кур старше 20 нед отмечали незначительное число ПЦР-положительных результатов (семь ПЦР-позитивных проб) на фоне тем не менее высокой серопревалентности (возможно, из-за клиренса вируса на момент отбора материала). В нашем исследовании вирус выявляли у кур в возрасте примерно от 4 до 56 нед (см. табл.).

Итак, методом ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией) нами выявлены 14 изолятов вируса гепатита Е (ВГЕ), обозначенных как российские (13 — у кур на птицефабриках Российской Федерации и один — в Казахстане). Большую часть изолятов (9 шт.) регистрировали у кур без признаков патологии печени и селезенки, а также без снижения яйценоскости и повышенной смертности. Анализ показал, что семь российских изолятов образуют самостоятельную генетическую линию, к которой 64

ïðèìûêàåò ëèíèÿ èç åùå äâóõ èçîëÿòîâ. Îñòàëüíûå ïÿòü èçîëÿòîâ âîøëè â îäíó ôèëîãåíåòè÷åñêóþ ãðóïïó ñ âèðóñàì åâðîïåéñêîãî ãåíîòèïà 3. Ïîëó÷åííûå íàìè ðåçóëüòàòû ïîäòâåðæäàþò èìåþùèåñÿ äàííûå î âûñîêîé ãåíåòè÷åñêîé ãåòåðîãåííîñòè âèðóñà ãåïàòèòà Å ó êóð, øòàììû êîòîðîãî öèðêóëèðóò âî âñåì ìèðå. Àíàëèç âàðèàáåëüíîñòè îáðàçöîâ ÂÃÅ èç ðàçíûõ ñòðàí ïîêàçûâàåò, ÷òî èñòîðè÷åñêîå ðàçäåëåíèå íà ãåíîòèïû ïî ãåîãðàôè-÷åñêîìó ïðèçíàêó â íàñòîÿùåå âðåìÿ íåîáõîäèìî ïåðåñìîòðåòü.

ФГБУ Федеральный центр охраны здоровья животных,        Поступила в редакцию

600901 Россия, г. Вёадимир, мкр. Юрьевец, фгбу «впиизж».              20 августа 2013 года