Разработка метода выявления Anaplasma marginale с использованием ПЦР в реальном времени

Анаплазмоз крупного рогатого скота (КРС) — трансмиссивное инфекционное заболевание, вызываемое риккетсиями рода Anaplasma (отряд Riсkettsiales, семейство Anaplasmatacеa). Анаплазмоз КРС широко распространен во всем мире и приводит к значительным экономическим потерям вследствие уменьшения мясомолочной продуктивности скота, ущерба от недополучения молодняка и гибели животных. Возбудитель анаплазмоза КРС — риккетсия вида Anaplasma marginale, облигатный внутриклеточный паразит, поражающий эритроциты. Встречается также коинфекция КРС анаплазмами вида A. ovis (1). Источником возбудителя анаплазмоза служат инфицированные животные, переносчиками — около 20 видов клещей, а также кровососущие насекомые (2, 3). Кроме того, возможна механическая передача возбудителей от зараженных животных к здоровым через нестерильные инструменты при проведении зоотехнических мероприятий.

Анаплазмоз КРС, вызванный A. marginale , зафиксирован во многих тропических и субстропических странах, по всей территории США и Канады, а также в некоторых странах Европы, главным образом средиземноморских (4, 5). Это заболевание регистрируют на Украине, в Белоруссии, Молдавии, Казахстане, государствах Средней Азии и Закавказья. Согласно ветеринарной отчетности в РФ, по анаплазмозу неблагополучны субъекты Центрального, Северо-Западного и Приволжского федеральных округов (6).

В настоящее время для диагностики анаплазмоза применяют микроскопические и серологические методы, однако их чувствительность и специфичность недостаточно высоки. Результаты микроскопических исследований мазков крови ненадежны, особенно на ранних стадиях инфицирования и в случаях заболеваний, сопровождающихся тяжелой формой анемии (7, 8). Серологические методы, основанные на использовании антител к антигенам возбудителя анаплазмоза, имеют недостаточно высокую чувствительность и не позволяют дифференцировать А. marginale от других видов анаплазм (9-11). Преимущество ПЦР-диагностики заключается в высокой чувствительности и специфичности — она позволяет обнаружить возбудителя на самых ранних стадиях заболевания, в том числе в латентную фазу, и надежно дифференцировать анаплазмоз от ряда сходных по клиническим проявлениям патологий. Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения животных (OIE, the World Organization for Animal Health) ПЦР-диагностику A. marginale следует применять перед каждым перемещением животного на новое место и для подтверждения диагноза. Описаны разные методы ПЦР для детекции A. marginale (12-22), однако ни один из них не прошел полную валидацию.

Цель представленного исследования — разработка метода выявления Anaplasma marginale в крови крупного рогатого скота на основе ПЦР в реальном времени.

Методика. Для подбора праймеров использовали имеющиеся в базе данных GenBank последовательности гена msp4 разных изолятов A. marginale, а также A. centrale, A. ovis и A. phagocytophilum. Консервативные участки msp4, которые могут послужить праймерами и зондом, выявляли, пользуясь ресурсом сервера СlustalW2 , открытый доступ). Видоспецифичность праймеров и зонда оценивали, применяя алгоритм BLASTN .

Анализируемые образцы ДНК выделяли из цельной крови естественно заразившихся животных — КРС с инфекцией A. marginale , а также Sanguibacter keddieii , Propionibacterium acnes и Pseudomonas aeruginosa , и овец, инфицированных A. ovis. Для этого использовали набор Sorb-M («Синтол», Россия) согласно рекомендациям производителя.

Реакцию амплификации проводили в режиме реального времени в смеси, содержащей 10 мкл реактива для ПЦР LightCycler® 480 Probes Master («Roche», Швейцария); праймер MSP4-F 5 ′ -CATGAGTCACGA-AGTGGCT-3 ′ (0,5 мкМ), праймер MSP4-R 5 ′ -GGCACACTCACATCA-826

ATC-3 ′ (0,5 мкМ); флуоресцентно меченный зонд MSP4-probe 5 ′ -(Cy5)-AAGGGGGAGTAATGGGAGGTAGCT-3 ′ (0,1 мкМ); 3 мкл ДНК; общий объем реакционной смеси — 20 мкл. ПЦР выполняли на приборе LightCycler 96 («Roche», Швейцария) при следующих условиях: начальная денатурация в течение 2 мин при 95 ° С; 45 циклов — 15 с при 95 ° С, 15 с при 58 ° С, 15 с при 72 ° С. Сигнал флуореcценции снимали по каналу Cy5. Результаты ПЦР оценивали также методом электрофореза в 2 % агарозном геле.

Полученный в ПЦР фрагмент гена msp4 длиной 177 п.н. очищали с помощью набора GeneJET PCR Purification Kit («Life Technologies», США), лигировали в вектор pGEM-T («Promega», США) и клонировали в клетках Escherichia coli DH5. Для выявления колоний трансформантов, содержащих плазмиду pGEM- msp4 , проводили ПЦР с использованием пары стандартных праймеров для секвенирования M13 («Сибэнзим», Россия) с последующим анализом продуктов амплификации методом электрофореза в 2 % агарозном геле.

Целевые колонии инкубировали в течение ночи при 37 ° С в 2 мл жидкой среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Для очистки плазмидной ДНК использовали набор GeneJET Miniprep Kit («Thermo Fisher Scientific», США). Концентрацию плазмидной ДНК определяли с помощью набора PicoGreen® dsDNA Assay Kit («Thermo Fisher Scientific», США) на флуориметре QuantiFluor-ST («Promega», США). Секвенирование полученных плазмид pGEM- msp4 проводили методом Сэнгера с использованием набора ABI Prism Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США) и генетического анализатора Applied Biosystems 3130 («Life Technologies», США). Для определения аналитической чувствительности ПЦР была выполнена серия 10-кратных разведений плазмиды pGEM -msp4 и получены образцы, содержащие 10^0-10⁷ копий гена msp4 . Определение аналитической чувствительности ПЦР проводилось в трех повторностях.

Рис. 1. Электрофоретическое разделение ДНК, полученной в результате ПЦР с использованием оригинальных праймеров (MSP4-F и MSP4-R) и ДНК, выделенной из крови инфицированных (1, 3-5, 7-9) и не инфицированных Ana-plasma marginale (2, 6) коров: М — маркер размера фрагментов ДНК (100-1000 п.н., «Диа-лат Лтд.», Россия). Стрелкой отмечен фрагмент размером 177 п.н.

Результаты. В представленном исследовании были разработаны праймеры и зонд для амплификации и детекции фрагмента гена msp4 (major surface protein 4) А. marginale методом ПЦР в реальном времени. Msp4 — имму-нодоминантный белок наружной мембраны всех известных на сегодняшний день риккетсий рода Ana-plasma (5, 23). Согласно результатам полногеномного секвенирования, у А. marginale msp4 представлен одной копией (24). Праймеры на основе гена msp4 для филогенетического анализа А. marginale ранее были предложены J. de la Fuente с соавт. (13), однако они не видоспецифичны для этой анаплазмы, так как имеют 100 % идентичность с соответствующими участками гена msp4 анаплазмы A. ovis, вследствие чего их нельзя использовать для дифференцирования двух этих патогенов. Также были предложены праймеры на основе msp4 для дифференциального выявления А. marginale и A. ovis методом классической ПЦР с идентификацией продуктов амплификации посредством электрофореза в агарозном геле (17). Преимущество метода ПЦР в реальном времени перед классической

ПЦР заключается в том, что регистрация накопления ДНК происходит непосредственно в процессе ПЦР, то есть детекция результатов как дополнительный этап анализа отсутствует. Это значительно сокращает время исследования, а сочетание праймеров и видоспецифичного флуоресцентно меченного зонда повышает надежность правильной идентификации патогена.

Подобранные праймеры MSP4-F и MSP4-R были использованы для проведения ПЦР, в которой матрицей служила ДНК коров, инфицированных A. marginale , что подтвердили результаты проведенного нами ранее секвенирования фрагментов генома КРС (25), а также ПЦР с праймерами AmargMSP4Fw 5 ′ -CTGAAGGGGGAGTAATGGG-3 ′ и AmargMSP4Rev 5 ′ -GGTAATAGCTGCCAGAGATTCC-3 ′ к msp4 у A. marginale , предложенными A. Torina с соавт. (17). В результате ПЦР с разработанными нами праймерами MSP4-F и MSP4-R (рис. 1) были получены и секвенированы фрагменты ДНК длиной 177 п.н.

Рис. 2. Кривые изменения флуоресценции при ПЦР в реальном времени для последовательных 10-кратных разведений плазмиды pGEM- msp4 (А) и оценка порога чувствительности (зависимость между необходимым числом циклов ПЦР и исходным числом копий гена msp4 в реакционной смеси) (Б) . LightCycler 96 («Roche», Швейцария; сигнал флуореcценции снимали по каналу Cy5).

были использованы для ПЦР в реальном

Анализ нуклеотидных последовательностей ампликонов показал, что они имеют 99-100 % идентичности с фрагментом гена msp4 у разных изо-лятов A. marginale. Эти же праймеры MSP4-F и MSP4-R и зонд MSP4-pro- be

времени. Во всех образцах

ДНК инфицированных коров наблюдалось экспоненциальное нарастание флуоресценции.

Для испытания специфичности праймеров MSP4-F и MSP4-R и зонда MSP4-probe использовались образцы ДНК овец, зараженных риккетсиями A. ovis , что было установлено в результате ПЦР с праймерами AovisMSP4Fw 5 ′ -TGAAGGGAGCGGGGTCATGGG-3 ′ и AovisMSP4Rev

5 ′ -GAGTAATTGCAGCCAGGGACTCT-3 ′ к гену msp4 A . ovis (17), а также образцы ДНК коров, которые по результатам секвенирования (25) содержали ДНК бактерий Sanguibacter keddieii , Propionibacterium acnes и Pseudomonas aeruginosa. При ПЦР-анализе этих образцов ДНК в режиме реального времени не наблюдали роста флуоресценции, характерного для материала от зараженных A. marginale животных, а при электрофоретическом разделении какие-либо продукты ПЦР отсутствовали, что свидетельствует о видоспецифичности праймеров и зонда.

При определении аналитической чувствительности ПЦР была сконструирована плазмида pGEM-msp4 с фрагментом гена msp4 длиной 177 п.н. (стандарт) и в результате серии последовательных 10-кратных разбавлений стандарта получены образцы, содержащие 100-107 копий фрагмента гена msp4. Результаты ПЦР с этими образцами стандартов в качестве матрицы и разработанными нами праймерами и зондом показали, что чувствительность метода позволяет выявлять в исследуемом объеме образца 102 копий гена msp4 и более (рис. 2), то есть, учитывая однокопийность этого гена (24), от 100 молекул ДНК A. marginale.

Следует отметить, что разработанный нами метод выявления A. marginale отличается от существующих аналогов (13, 17) высокой специфичностью, быстротой анализа, а также возможностью количественной оценки бактериальной нагрузки.

Таким образом, нами разработана пара праймеров и зонд к гену msp4 для дифференциального выявления риккетсий вида Anaplasma marginale в крови крупного рогатого скота методом ПЦР в реальном времени. Чувствительность метода позволяет выявлять от 10² копий гена msp4 А. marginale в анализируемом объеме образца ДНК, а специфичность достаточна для того, чтобы надежно дифференцировать A . marginale и A . ovis , то есть предложенный метод (в отличие от описанных в литературе) высокоспецифичен. Более того, он дает возможность количественно оценивать бактериальную нагрузку, при этом процедура требует меньшего времени. Поэтому его можно использовать в случае необходимости оперативного дифференциального обнаружения и количественного определения А. marginale в образцах крови инфицированного крупного рогатого скота с целью подтверждения диагноза и при проведении эпидемиологического мониторинга анаплазмоза.