Разработка метода выявления Anaplasma marginale с использованием ПЦР в реальном времени

Риккетсия Anaplasma marginale - возбудитель анаплазмоза крупного рогатого скота. Заболевание протекает с признаками анемии, лихорадки и потерей веса, вызывает аборты и снижение удойности у коров и во многих случаях приводит к гибели зараженных животных. A. marginale переносится клещами и кровососущими насекомыми. Анаплазмоз обычно диагностируется при микроскопическом исследовании мазков крови, окрашенных по Романовскому красителем Гимза, но этот метод ненадежен, если животное находится на ранних стадиях инфицирования. Широко используются серологические методы диагностики, однако они не позволяют дифференцировать А. marginale от других видов анаплазм. Подход, основанный на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, сочетает высокую специфичность анализа и возможность количественной оценки числа копий ДНК патогена в образце. Цель выполненного нами исследования - разработать метод дифференцированного выявления A. marginale в крови крупного рогатого скота с помощью ПЦР в реальном времени. В качестве мишени для амплификации был выбран однокопийный ген msp4. Msp4 - иммунодоминантный белок наружной мембраны всех известных на сегодняшний день риккетсий рода Anaplasma. Праймеры на основе гена msp4 для филогенетического анализа А. marginale ранее были предложены J. de la Fuente с соавт. (2001), однако они не видоспецифичны. В результате анализа нуклеотидных последовательностей гена msp4 разных изолятов A. marginale и близкородственных видов анаплазм, включая A. ovis, выявили характерные для A. marginale участки, на основе которых были разработаны видоспецифичные праймеры и флуоресцентно меченный зонд (MSP4-F 5′-CA-TGAGTCACGAAGTGGCT-3′ и MSP4-R 5′-GGCACACT-CACATCAATC-3′, MSP4-probe 5′-(Cy5)-AAGGGGGAGTAATGGGAGGTAGCT-3′) для амплификации и детекции фрагмента гена msp4 A. marginale длиной 177 п.н. методом ПЦР в реальном времени. Анализ амплифицированных нуклеотидных последовательностей показал, что они имеют 99-100 % идентичности с фрагментом гена msp4 у разных изолятов A. marginale. При определении аналитической чувствительности ПЦР была сконструирована плазмида pGEM -msp4 с фрагментом гена msp4 длиной 177 п.н. и получены образцы, содержащие 10 0-10 7 копий msp4. Показано, что чувствительность метода позволяет выявлять от 10 2 копий гена msp4 А. marginale в анализируемом объеме образца ДНК. Для испытания аналитической специфичности праймеров и зонда использовались образцы ДНК овец, зараженных риккетсиями A. ovis, а также ДНК коров, которые по результатам секвенирования содержали ДНК бактерий Sanguibacter keddieii, Propionibacterium acnes и Pseudomonas aeruginosa. При этом роста флуоресценции, характерного для материала от зараженных A. marginale животных, и каких-либо продуктов ПЦР при электрофоретическом разделении не наблюдали. Таким образом, специфичность метода позволяет надежно дифференцировать A. marginale и A. ovis. Разработанный способ выявления A. marginale на основе амплификации и детекции фрагмента гена msp4 с помощью ПЦР в реальном времени отличается от существующих аналогов высокой специфичностью, быстротой, а также возможностью количественной оценки бактериальной нагрузки. Метод может быть использован для оперативного дифференциального обнаружения и количественного определения А. marginale в образцах крови инфицированного крупного рогатого скота с целью подтверждения диагноза и при проведении эпидемиологического мониторинга анаплазмоза.