Активность окислительно-восстановительных ферментов у разных по устойчивости к заразихе генотипов подсолнечника

Введение. Заразиха ( Orobanche сumana Wallr.) паразитирует на культурном подсолнечнике (Helianthus annuus L.), в результате чего потери урожая семян подсолнечника в странах средиземноморья и Восточной Европы составляют 50–90 % [1].

На подсолнечнике известно восемь рас O. сumana : A, B, C, D, E, F, G, H. Три последние из них – самые вирулентные, на протяжении последнего десятилетия были обнаружены сначала в Румынии, затем в Испании и Турции. В этих странах были созданы дифференциаторы устойчивости подсолнечника к каждой из них.

В последние годы в регионах юга РФ и в основных регионах Украины, где возделывается подсолнечник, тоже начали рас- пространяться новые расы заразихи, начавшие поражать весь отечественный сортимент и гибриды иностранной селекции. Актуальными стали все аспекты борьбы с этим злостным паразитом [7].

Для создания устойчивых форм подсолнечника к данному паразиту обязательным условием является проведение предварительной оценки исходного материала. Такая оценка может проводиться различными, доступными для исследователей методами: морфологическими [2], гистологическими [3; 4], биохимическими [5; 6], молекулярными [1].

Выявить новые расы с помощью линий-дифференциаторов не всегда возможно. Анализ устойчивости исходного материала с помощью морфологических и гистологических методов отличается высокой трудоемкостью. Идентификация генов устойчивости к определенным расам заразихи методами молекулярной генетики затруднена из-за отсутствия маркеров к новым агрессивным расам и высокой стоимости этих методов. В связи с этим целесообразна разработка новых экспрессных и надежных методов оценки устойчивости исходного материла подсолнечника к заразихе без учета расы паразита.

Известно, что при внедрении паразита в корневую систему растения-хозяина происходит усиление метаболизма фенольных соединений, которые концентрируются в местах внедрения, образуя защитный слой [4].

В этом процессе участвуют полифено-локсидаза (ПФО) (КФ1.10.3.1), пероксидаза (ПОД) (КФ1.11.1.7), каталаза (КАТ) (КФ1.11.1.6), которые играют важную роль в ответе растения на заражение и в формировании устойчивости к паразитам [8; 9]. Активность этих ферментов исследовали у пшеницы, ячменя, перца, капусты и других сельскохозяйственных культур в связи с их устойчивостью к биотическому стрессу [2; 3]. Для подсолнечника данные об активности ферментов в условиях биотического стресса ограничены.

Так, показано, что при поражении корзинок подсолнечника возбудителем серой гнили ( Botrytis cinerea Fr.) активность ПФО у устойчивых сортов возрастала. У восприимчивых растений при поражении патогеном активность полифенолоксида-зы повышается незначительно или не изменяется. По мнению авторов, в корзинках устойчивых растений в ответ на поражение возбудителем серой гнили происходит быстрое окисление фенолов, вследствие чего скорость образования химического барьера из его продуктов опережает скорость проникновения гриба [10;11].

У генотипов подсолнечника, устойчивых к возбудителю ложной мучнистой росы ( Plasmopara halstedii (Farl.) Berlese et de Toni) [7], а также Alternaria helian-thini (Hansf.) Tub. et Nish. [12], выявлена повышенная активность пероксидазы.

Установлена также более высокая активность пероксидазы у устойчивых форм подсолнечника, инокулированных возбудителем заразихи, по сравнению с восприимчивыми. После инокуляции Orobanche cumana Wallr. , активность фермента восприимчивых генотипов не имела существенных отклонений от активности его у неинокулированных или даже снижалась [13].

Таким образом, литературные данные показывают, что под влиянием патогенов у разных сельскохозяйственных растений изменяется активность оксидаз. Вместе с тем, закономерной связи уровня активности пероксидазы, полифенолоксидазы и каталазы с уровнем устойчивости подсолнечника к заразихе не выявлено.

Ранее мы исследовали у подсолнечника активность ПФО, ПОД, КАТ при инокуляции растений заразихой [14; 15; 16]. Результаты показали, что у пораженных заразихой растений подсолнечника активность этих ферментов была выше, чем у растений, выращенных без инокуляции. При этом показатели ферментативной активности у устойчивых образцов сущест- венно превышали показатели восприимчивых.

В связи с вышеизложенными данными целью нашей работы было определить активность этих оксидаз у генотипов подсолнечника на неинфекционном фоне и установить возможность прогнозирования уровня устойчивости по этому показателю для создания экспресс-метода оценки на устойчивость к заразихе.

Материалы и методы. Материалом для исследований были 14-дневные проростки стерильных материнских и фертильных отцовских линий подсолнечника и их гибриды селекции института растениеводства им. В.Я. Юрьева НААН, занесенные в Государственный реестр сортов растений Украины (перечень приведен в таблице).

Предварительная оценка исследуемого материала, проведенная нами традиционным (морфологическим) методом, показала, что отобранные генотипы характеризовались разной устойчивостью к заразихе: низкоустойчивая линия -стандарт восприимчивости (100–90 % пораженных растений, среднее количество проростков заразихи 6,14 шт. на растении), средне- и высокоустойчивые (с числом клубеньков заразихи от 0,83 до 4,5 шт. на растении), в том числе и линия-стандарт устойчивости (таблица). Эти результаты совпадают с оценкой устойчивости по Каталогу [17; 18].

Растения выращивали в условиях искусственного климата при 22-25/18-20 оС (день/ночь) и фотопериоде 16 часов. Исследовали по 10 растений каждого генотипа. С каждого растения брали навеску 500 мг надземной массы и растирали в фарфоровой ступке с 1/15 М фосфатным буфером. Полученную ферментную вытяжку центрифугировали 10 мин на центрифуге ЦУМ-1 (Завод физических приборов, Киргизская ССР) и в супернатанте определяли активность ферментов фотоколориметрическим методом на фотоэлектроколориметре КФК-2-УХЛ 4.2 (РСФСР). Активность полифенолоксида- зы (ПФО) определяли по скорости окисления ферментом пирокатехина (длина волны 420 нм), пероксидазы (ПОД) - по скорости окисления гваякола (длина волны 470 нм) [19], каталазы (КАТ) - по оптической плотности раствора комплексного соединения молибдата аммония и перекиси водорода (длина волны 405 нм) [20].

Активность ферментов выражали в условных единицах на грамм сырой ткани (ус. ед./г тк.) и обрабатывали стандартными методами вариационной статистики [21].

Результаты и обсуждение. Результаты определения активности ПФО показали, что у всех материнских и отцовских линий, а также у их гибридов активность этого фермента была существенно выше, чем у линии-стандарта восприимчивости (таблица). Активность ПФО у большинства линий и гибридов была ниже или такая же, как у линии-стандарта устойчивости. Только у линий С х 2552А и Сх1006А, а также у гибридов С х 908А/Х114В и С х 2111А/Х711В активность ПФО была выше, чем у линии-стандарта устойчивости (таблица). Поскольку активность этого фермента у линии-стандарта устойчивости существенно более высокая, чем у линии-стандарта восприимчивости, и при этом она более высокая у исследованных линий и гибридов, это позволяет предположить, что ПФО является одним из важных компонентов формирования свойства устойчивости подсолнечника к заразихе.

Определение активности пероксидазы показало, что у большинства материнских и отцовских линий, а также у гибридов ее активность была существенно более низкой, чем у линии-стандарта восприимчивости. Только у материнской линии Сх 1006А, отцовских линий Х711В, Х7620В и гибридов Сх503А х Х114В и Сх1006 х Х720В она была более высокой, чем у линии-стандарта восприимчивости (таблица).

Таблица

Активность оксидаз у линий и гибридов подсолнечника с разным уровнем устойчивости к заразихе, усл.ед./г тк.

Линия, гибрид	Число клубень ков, шт./раст.	Активность ферментов
		полифенол-оксидазы	пероксидазы	каталазы
Стерильные материнские линии
Сх503А	0,83±0,2*	76,3 + 2,4*	10,1±1,3*	6,3±1,4*
Cx2111А	1,0±0,3*	69,1 + 1,3*	7,7±0,5*	3,4±0,6*
Сх1002А	2,22±0,6*	79,1 + 2,4*	13,6±1,6*	4,0±0,5*
Сх1012А	1,14±0,4*	70,0 + 3,0*	15,6±1,7	2,7 + 0,6
Сх2552А	4,5±0,6*	82,5 + 1,1*	14,5±2,3	10,1±0,7*
Сх1006А	2,0±0,3*	82,2 + 2,4*	19,1±1,4	2,6±0,4*
Фертильные отцовские линии
Х114В	2,83±0,2*	72,0 + 3,3*	9,2±1,0*	3,4 + 0,5*
Х711B	3±0,4*	72,0 + 3,3*	28,3±3,6*	2,8±0,4*
Х720В	3,5±0,6*	78,0 + 1,4*	20,5±2,4	7,1 + 1,3*
Х762В	1,0±0,3*	71,3 + 4,7*	8,3±1,1*	7,7 + 2,0*
Х526В	3,3±0,8*	73,0 + 5,0*	5,7±1,0*	1,9±0,3
Гибриды
Сх503А/Х114В	4,56±1,0*	78,7 + 0,8*	20,1±1,2	3,2±0,4*
Сх908А/Х762В	4,0±0,8*	80,2 + 0,9*	7±1,6*	4,6±0,5*
Сх1006А/Х720В	4,9±0,9*	73,9 + 1,3*	19,2±7,3	3,1±0,3*
Сх1012А/Х526В	2,8±0,3*	73,5 + 1,2*	8,1±0,9*	6,6±0,4*
Cx2111А/Х711B	2,44±0,4*	83,5 + 2,1*	13,9±2,4*	6,2±0,5*
Сх908А – стандарт восприимчивости	6,14±1,1*	56,7 + 2,4*	17,6±2,4*	2,0±0,4*
PR64A71 – стандарт устойчивости	0,0 ±0	77,25±1,5	12,8±2,9	5,6±0,64

*Разница между показателями опытных образцов и линии-стандарта восприимчивости достоверна при Р<0,05

Активность ПОД у большинства материнских линий (у четырех из шести), у двух отцовских (из пяти) и трех гибридов (из пяти) была более высокой, чем у линии-стандарта устойчивости. То есть у большинства исследуемого материала активность этого фермента была ниже, чем у линии-стандарта восприимчивости, но выше, чем у линии-стандарта устойчивости (таблица). Так как активность этого фермента у линии-стандарта устойчивости ниже, чем у линии-стандарта восприимчивости, то, по-видимому, он также играет определенную роль в физиологобиохимических механизмах формирования устойчивости подсолнечника к зара- зихе. Однако, судя по нашим данным, активность пероксидазы в защитных реакциях этого растения в ответ на заражение в меньшей мере значима, чем активность полифенолоксидазы.

Результаты определения активности каталазы показали, что у подавляющего большинства линий и гибридов она была более высокой и только у отцовской линии Х526В такой же, как у линии-стандарта восприимчивости. По сравнению с активностью этого фермента у линии-стандарта устойчивости у исследованных линий и гибридов она была или более высокой или более низкой, что может свидетельствовать о разном уровне устойчивости к заразихе исследуемых образцов подсолнечника, а также о влиянии особенностей генотипа на уровень устойчивости (таблица).

Поскольку уровень активность каталазы у исследованных линий и гибридов совпадает с уровнем ее активности у линии-стандарта устойчивости, превышая активность линии-стандарта восприимчивости, то это позволяет считать, что этот фермент является одним из важных элементов, составляющих физиологобиохимическую систему формирования устойчивости подсолнечника к заразихе.

Таким образом, результаты опытов позволяют предположить, что исследованные оксидазы являются компонентами физиолого-биохимических защитных механизмов подсолнечника при поражении заразихой. Более четкая связь устойчивости исследованного материала к этому патогену выявлена с помощью активности полифенолоксидазы и каталазы. Это позволяет считать, что повышенная активность этих ферментов у исследованного материала, как и у линии-стандарта устойчивости, может служить критерием оценки его устойчивости к заразихе. Поскольку методики определения активности полифенолоксидазы и каталазы относительно простые, не требуют значительных затрат времени, как традиционный (морфологический) метод, и дорогих реактивов и оборудования, как молекулярно-генетические методы, то целесообразно использовать показатели активности этих ферментов для оценки и идентификации исходного материала подсолнечника, устойчивого к заразихе.