Активность супероксиддисмутазы в спермоплазме и качество спермы жеребцов

В современном отечественном коневодстве большое значение уделяется устойчивости половых клеток к криоконсервации, так как искусственное осеменение обеспечивает высокие результаты только тогда, когда в работе используют здоровых жеребцов-производителей с высоким качеством и криоустойчивостью спермы [7].

Известно, что действие на организм неблагоприятных факторов химической и физической природы избыточно усиливает процессы свободнорадикального окисления (СРО) [2]. Антиоксидантная система организма регулирует уровень СРО и защищает клетки и ткани от накопления токсичных продуктов окисления и включает в себя: ферменты, неферментные белки и низкомолекулярные соединения [4, 5]. Активные формы кислорода (АФК) уравновешиваются антиоксидантной системой защиты, которая не допускает возникновения окислительного стресса (ОС) [1]. Антиоксиданты нейтрализуют цепную реакцию, ведущую к образованию ОС, тем самым защищая организм от негативного воздействия токсических соединений [1, 3].

Необходимо отметить, что при криоконсервации спермы жеребцов значительно возрастают показатели ОС и повреждения плазматических мембран сперматозоидов, которые в дальнейшем активируют несколько путей разрушения клеток, что в конечном итоге приводит к фрагментации их ДНК [9]. Добавление антиоксидантов в среду для криоконсервации снижает уровень структурных повреждений сперматозоидов и потерю их подвижности от перекисного окисления липидов (ПОЛ) [10, 11].

Семенная плазма, которая вырабатывается придаточными половыми железами, придатками семенников и семенниками, создает для сперматозоидов оптимальную среду и имеет большой запас антиоксидантов: ферментативных (каталаза, глутатионпероксидаза и супероксиддисмутаза) и неферментативных (множество соединений, поступающих в организм с кормом) [6, 8]. Самыми основными антиоксидантными ферментами в спермоплазме жеребцов являются: супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза, способные катализировать анион супероксида, перекись водорода и перекись липидов [12, 14].

Целью настоящего исследования стало изучение активности антиоксидантного фермента – супероксиддисмутазы (СОД) в спермоплазме у жеребцов с высокой и низкой прогрессивной подвижностью (ПП) сперматозоидов.

Материал и методы исследований. Исследования проводили в 2021 году на базе АО «Терский племенной конный завод № 169» (Ставропольский край) на 16 жеребцах арабской чистокровной породы в возрасте от 5 до 15 лет (в среднем 8,5±4,5 лет). Сперму, предназначенную для исследований, получали в период случного сезона (март- апрель) согласно «Рекомендации по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов» (2006). После получения спермы в каждом эякуляте определяли объем и концентрацию сперматозоидов (фотометр SDM1 Minitube GmbH, Tiefenbach, Германия). Далее эякулят делили на две части, одну часть разбавляли лактозо-хелато-цитратножелточной средой (ЛХЦЖ), в соотношении 1:3, определяли прогрессивную подвижность и выживаемость сперматозоидов при температуре 2-4 ˚С. Оценку прогрессивной подвижности (ПП) сперматозоидов проводили с использованием системы Argus CASA (ArgusSoft LTD., Санкт-Петербург, Россия) и микроскопа Motic BA 410 (Motic, Гонконг, Китай) в камере Маклера (Sefi-Medical Instruments Ltd., Израиль) при 37 ˚С. Для оценки выживаемости сперматозоидов (в часах) определяли их прогрессивную подвижность с интервалом 24 часа вплоть до снижения ПП до 5 %.

Другую часть эякулята сразу после получения центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин. После семенной плазмы, свободные от сперматозоидов, замораживали в пробирках типа Эппендорф (2,0 мл) и хранили при температуре -18 ˚С до проведения исследований. Исследование активности супероксиддисмутазы в спермоплазме проводили на иммунохимическом анализаторе Tecan Austria Sunrise (Bender Medsystems, Австрия).

Статистическую обработку проводили с использованием программ Statistica 13.3 (StatSoft, Россия) и Microsoft Office Exsel 2016. Достоверность различий определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты представлены в виде среднеарифметической (М) и ее стандартной ошибки (m), минимальных (Min) и максимальных (Max) значений. Отличия считали статистически значимыми при Р <0,05.

Исследования проводились при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-16-00101-П).

Результат исследований. В таблице 1 приведены значения показателей спермы жеребцов, а также активности супероксиддисмутазы спермоплазмы.

микроскопии супернатанта аликвоты

Таблица 1  – Показатели спермы жеребцов, активность супероксиддисмутазы в спермоплазме, М±m, (Min, Max), (n=16)

Наиболее точную оценку ПП сперматозоидов позволяет определить компьютерный анализ спермы (Рисунок 1). Компьютерная оценка учитывает количество сперматозоидов с прогрессивной и непрогрессивной подвижностью и количество неподвижных клеток в поле зрения.

Супероксиддисмутаза преобразует супероксидный радикал в перекись водорода, тем самым являясь ключевым фактором защиты клеток от окислительного стресса. В исследованиях Papas M. et al. (2019) установлено, что супероксиддисмутаза положительно влияет на общую и прогрессивную подвижность сперматозоидов в спермоплазме жеребцов. Сперма жеребцов с высоким содержанием супероксиддисмутазы в процессе криоконсервации выдерживает окислительный стресс благоприятнее, чем у жеребцов с низким содержанием этого фермента [12]. Partyka А. et al. (2013) установили, что при добавлении в разбавитель для спермы супероксиддисмутазы перекисное окисление липидов в плазматической мембране сперматозоидов петухов снижалось [13].

Рисунок 1 – Компьютерная оценка прогрессивной подвижности сперматозоидов с использованием системы Argus CASA, где 1 – сперматозоид с прогрессивной подвижностью, 2 – сперматозоид с непрогрессивной подвижностью, 3 – неподвижный сперматозоид

Таблица 2 – Показатели спермы и активности СОД в спермоплазме у жеребцов с высокой и низкой ПП сперматозоидов, М±m, (n=16)

Примечание: * отмечены значения Р <0,05, ** отмечены значения Р <0,01

Для изучения взаимосвязи между активностью СОД в спермоплазме и качеством спермы жеребцов, всех исследуемых животных разделили на две группы в зависимости от показателя прогрессивной подвижности (ПП) сперматозоидов в нативной сперме (ГОСТ23681-79). В первую группу включили 6

жеребцов с ПП сперматозоидов в нативной сперме ниже 50 %. Во вторую группу включили 10 жеребцов с ПП сперматозоидов в нативной сперме выше 50 % (Таблица 2). По результатам исследования установили, что у жеребцов 2-ой группы (с высокой ПП сперматозоидов) активность СОД в спермоплазме была выше, чем у жеребцов 1-ой группы (P <0,05).

Заключение. Проведение исследования активности супероксиддисмутазы семенной плазмы позволило изучить взаимосвязь между этим антиоксидантным ферментом спермоплазмы и показателями спермы жеребцов.

Установили, что у жеребцов 2-ой группы (с высокой прогрессивной подвижностью сперматозоидов) активность супероксиддисмутазы в спермоплазме была выше и достоверно отличалась от жеребцов 1-ой группы (с низкой прогрессивной подвижностью сперматозоидов) (P <0,05).

Предполагаем, что активность супероксиддисмутазы в спермоплазме можно использовать в качестве биохимического маркера при отборе жеребцов с лучшими показателями качества спермы.