Анализ эффективности применения молекулярно-генетического типирования для определения фенотипа пациентам с химеризмом по антигенам эритроцитов системы резус
Автор: Гавровская С.В., Сысоева Е.А., Минеева Н.В., Бессмельцев С.С.
Журнал: Вестник гематологии @bulletin-of-hematology
Рубрика: Оригинальные статьи
Статья в выпуске: 4 т.19, 2023 года.
Бесплатный доступ
В терапии гематологических заболеваний широко используются трансфузии компонентов крови, как единичные, так и многократные. Трансфузии донорских эритроцитов не всегда проводятся «фенотип в фенотип», что впоследствии приводит к выявлению двойных популяций (химер) эритроцитарных антигенов в крови реципиента при определении фенотипа методом агглютинации в геле. Недостоверные результаты определения антигенного состава эритроцитов реципиента могут быть причиной ошибок при подборе донорских эритроцитов, что может привести к аллоиммунизации. При следующих трансфузиях растет риск посттрансфузионных осложнений гемолитического типа. Решением проблемы может быть применение молекулярного- генетического типирования для точного определения антигенного состава эритроцитов реципиента. Цель исследования – использовать молекулярно- генетическое типирование для определения анти- генов эритроцитов пациентам с трансфузионным химеризмом для предотвращения ошибок при под- боре донорских эритроцитов. Проанализировать встречаемость двойных популяций (химер) после трансфузионной терапии донорскими эритроцита- ми, подобранными с учетом генотипа реципиента. За 2019-2022 гг. методом агглютинации в геле из 1737 первично госпитализированных лиц с гематологическими заболеваниями у 129 (7,4%) пациентов были выявлены двойные популяции (химеры) по антигенам эритроцитов С, с, Е, е. Эти пациенты были генотипированы, несоответствие результатов молекулярно-генетического метода и метода агглютинации в геле составило 66 случаев (51,2%). Транс- фузии эритроцитов пациентам исследуемой группы проводились с учетом генотипа. При последующих госпитализациях в 2020 – 2021 – 2022 г.г. количество пациентов с химеризмом в группе обследуемых снижалось соответственно 77,8 – 50,0 – 36,0 %. Аллоантитела не были обнаружены ни у одного из 129 пациентов. Молекулярно-генетическое типирование позволило получить достоверный результат. Отсутствие двойных популяций и аллоантител при повторных госпитализациях пациентов доказывает эффективность применения молекулярно-генетических методов при подборе донорских эритроцитов для трансфузий.
Антигены эритроцитов, фенотип, трансфузии, химеризм
Короткий адрес: https://sciup.org/170199870
IDR: 170199870
Analysis of the effectiveness of the use of molecular genetic typing to determine the phenotype of patients with chimerism by rhesus erythrocyte antigens
Transfusions of blood components, both single and multiple, are widely used in the treatment of hematological diseases. Transfusions of donor erythrocytes are not always carried out "phenotype to phenotype". It leads to the identification of double populations (chimeras) of erythrocyte antigens in the recipient's blood when determining the phenotype by agglutination in gel. Unreliable results may cause errors in the selection of donor erythrocytes and lead to alloimmunization. With the following transfusions, the risk of posttransfusion complications of the hemolytic type increases. The solution to the problem may be the use of molecular genetic typing. The aim of the study was use molecular genetic typing to determine patient phenotype to prevent errors in the selection of donor erythrocytes and to analyze the occurrence of chimeras after transfusion therapy into account the recipient genotype. In 2019-2022 chimeras of the antigens C, c, E, e were detected in 129 (7.4%) patients out of 1737 primary hospitalized persons with hematological diseases by the method of agglutination in gel. These patients were genotyped, the discrepancy between the results of the molecular genetic method and the method of agglutination in gel was 66 cases (51.2%). Transfusions of erythrocytes to patients of the study group were performed into account the genotype. With subsequent hospitalizations in 2020 – 2021 – 2022 the number of patients with chimerism decreased accordingly 77,8 – 50,0 – 36,0 %. Alloantibodies were not found in any of the 129 patients. Molecular genetic typing allowed us to obtain a reliable result. The absence of double populations and alloantibodies proves the effectiveness of the use of molecular genetic methods in the selection of donor erythrocytes for transfusions.
Текст научной статьи Анализ эффективности применения молекулярно-генетического типирования для определения фенотипа пациентам с химеризмом по антигенам эритроцитов системы резус
Материалы и методы. Было выполнено серологическое типирование 1737 первично госпитализированных пациентов с различными гематологическими заболеваниями, проходивших лечение в ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства». Типирование проводили методом агглютинации в геле в ID-картах DiaClon Rh-Subgroups+K в соответствии с инструкциями производителя (BIO-RAD, Швейцария). Характер агглютинации оценивали в интервале от 1+ до 4+. У 129 лиц были выявлены двойные популяции (химеры) по одному или нескольким антигенам эритроцитов системы Резус С, с, Е, е. что явилось критерием отбора образцов для молекулярно-генетического типирования.
Генетические исследования проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием молекулярной системы детекции на анализаторе FluoVista (Inno-Train, Германия) с помощью аллель-специфических праймеров – SSP ПЦР (SSP: «Sequence Specific Priming»). Аллели генов RHD и RHCE, опосредующие антигенные свойства эритроцитов, определяли с использованием набора реактивов RBC-FluoGene vERYfy (Inno-Train, Германия). Набор позволяет определять 1, 5, 10 экзоны и psi (инсерция внутри 4-ого экзона) гена RHD, а также аллельные варианты гена RHCE.
Выделение геномной ДНК осуществляли с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-В» (AmpliSens, Россия) из цельной крови, взятой в пробирку с 5% К2ЭДТА. Для ПЦР использовали раствор ДНК в концентрации 1 нг/мкл.
Для достоверности различий встречаемости применяли непараметрический статистический метод для малых групп с использованием двухстороннего точного критерия Фишера. Различия рассматривали как статистически значимые при p <0,05.
Все обследованные пациенты подписали информированное согласие. Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России (протокол № 48 от 20.10.2022 г.).
Результаты и обсуждение. В течение 2019 – 2022 гг. проводился мониторинг выявления двойных популяций (химеризма) при исследовании антигенов эритроцитов серологическими методами у пациентов с разными гематологическими заболеваниями.
Из 1737 первично госпитализированных лиц у 129 (7,4%) методом агглютинации в геле были выявлены двойные популяции (химеры) по одному или нескольким антигенам эритроцитов системы Резус
(С, с, Е, е). В таблице 1 показан % встречаемости химеризма среди пациентов с разными гематологическими заболеваниями, нуждающихся в трансфузиях гемокомпонентов.
Таблица 1
Встречаемость химеризма в исследуемой группе по нозологии.
|
Диагноз |
Пациенты с химерами |
% |
|
Миелодиспластический синдром |
36 |
29,7 |
|
Острый лейкоз |
32 |
24,8 |
|
Хронический миелолейкоз |
18 |
14,0 |
|
Первичный миелофиброз |
11 |
8,5 |
|
Хронический лимфоцитарный лейкоз |
10 |
7,8 |
|
Множественная миелома |
9 |
7,0 |
|
Апластическая анемия |
7 |
5,4 |
|
Эссенциальная тромбоцитемия |
3 |
2,3 |
|
Макроглобулинемия Вальденстрема |
1 |
0,8 |
|
Неходжинская лимфома |
1 |
0,8 |
|
Истинная полицитемия |
1 |
0,8 |
Чаще всего двойные популяции антигенов выявлялись у пациентов с миелодиспластическим синдромом (29,7%), острым лейкозом (24,8%) и хроническим миелолейкозом (14,0%). Реже двойные популяции антигенов обнаруживались у пациентов с первичным миелофиброзом, хроническим лимфоцитарных лейкозом, апластической анемией и множественной миеломой. Среди пациентов с другими нарушениями кроветворной системы «химеризм» наблюдался в 0,8 – 2,3% случаев.
При генотипировании пациентов с выявленным химеризмом было получено несоответствие результатов молекулярно-генетического метода и метода агглютинации в геле. Результаты отображены в таблице 2.
Таблица 2
Расхождение результатов серологического и молекулярно-генетического типирования у пациентов исследуемой группы
|
Антигены, по которым выявлено расхождение |
Количество случаев, n |
Несоответствие фенотип/генотип (n) |
|
C |
14 |
CхcDEe / ccDEe (10) |
|
CхcDee / ccDee (3) |
||
|
Cхcddee / ccddee (1) |
||
|
E |
22 |
CcDEхe / CcDee (21) |
|
ссDЕхe / ccDee (1) |
||
|
c |
15 |
CcхDee / CCDee (14) |
|
Ccхddee / CCddee (1) |
||
|
e |
4 |
ссDEех / ccDЕЕ (4) |
|
сЕ |
5 |
CcхDЕхe / CCDee (5) |
|
CE |
3 |
CхcDEхe / ccDee (3) |
|
Се |
3 |
CхcDEeх / ccDЕЕ (3) |
Примечание: нижний индекс «х» справа от буквенного обозначения антигена означает наличие двойной популяции при исследовании методом агглютинации в геле.
По одному антигену системы Rh расхождения наблюдались у 55 пациентов, по двум антигенам у 11. Всего 66 случаев из 129 (51,2%). Чаще встречались расхождения результатов определения антигенов С и Е, иммуногенность которых достаточно высока. Аллоантитела к антигену Е встречаются в 7%, анти-С антитела в 3% несовместимых трансфузий [7]. Причиной значительного количества недостоверных результатов определения фенотипа серологическим методом было наличие в крови пациентов популяций донорских эритроцитов от предыдущих трансфузий, неидентичных по антигенам системы Rh. Полученные нами данные согласуются с результатами других исследований, в которых расхождения между результатами генотипирования и фе-нотипирования у пациентов, имеющих в анамнезе трансфузии компонентов крови, колебались от 10% до 90% [8–10].
Все последующие гемотрансфузии пациенты исследуемой группы получали с учетом генотипа. Гемолитических реакций и осложнений зафиксировано не было. При повторных госпитализациях пациентам проводили фенотипирование методом агглютинации в геле, а также исследование плазмы крови на наличие антиэритроцитарных аллоанти-тел. Аллоантитела не были обнаружены ни у одного из этих больных. Мониторинг госпитализаций пациентов исследуемой группы за 2020 – 2022 годы показал, что повторяемость химеризма последовательно снижалась (Таблица 3).
Таблица 3
Количество повторно госпитализированных генотипированных пациентов с двойными популяциями эритроцитов
|
Год |
Повторно госпитализировано |
С двойными популяциями эритроцитов |
|
2020 |
27 |
21 (77,8%) |
|
2021 |
20 |
10 (50%) |
|
2022 |
14 |
5 (36%) |
По сравнению с 2020 г. в 2021 г. наметилась тенденция снижения количества таких пациентов (p=0,065), а в 2022 г. химеры встречались достоверно реже (p=0,015).
Двойные популяции эритроцитов встречаются не только у пациентов с множественными трансфузиями в анамнезе. После трансплантации костного мозга у пациентов наблюдается период смешанного гемопоэтического химеризма [11]. Молекулярно-генетический анализ позволяет оценить успешность приживления трансплантата, риск возможного его отторжения, рецидива и т.д. В случае присутствия алло- или аутоантител в крови пациента анализ методом агглютинации в геле также может быть затруднен [2,5,7,12]. При целом ряде заболеваний (лейкозы, пернициозная анемия, общая инфекция, цирроз печени, пневмония, нефрозо-нефрит, болезнь Рейно и др.) может наблюдаться и явление неспецифической агглютинации: сыворотка дает агглютинацию со всеми эритроцитами и даже с собственными, а эритроциты вызывают агглютинацию со всеми сыворотками и даже с сывороткой четвертой группы [7]. В таких случаях молекулярно-генетическое типирование можно рассматривать как альтернативный метод определения антигенного состава эритроцитов.
Выводы
-
1. Молекулярно-генетическое типирование антигенного состава эритроцитов реципиентов с трансфузионным химеризмом позволило получить до-
- стоверный результат.
-
2. Снижение количества пациентов с двойными популяциями и отсутствие аллоантител при повторных госпитализациях пациентов доказывает эффективность применения молекулярно-генетических методов при подборе донорских эритроцитов для трансфузий.
-
3. Проведение генотипирования может быть рекомендовано пациентам с множественными трансфузиями в анамнезе; имеющим антитела к антигенам эритроцитов; после трансплантации костного мозга и в других сложных случаях.
Список литературы Анализ эффективности применения молекулярно-генетического типирования для определения фенотипа пациентам с химеризмом по антигенам эритроцитов системы резус
- Bakanay S.M., Ozturk A., Ileri T. et al. Blood group genotyping in multi-transfused patients // Transfusion and Apheresis Science. – 2013. – Vol. 48, – P. 257–261.
- Пашкова И.А. Алгоритм разрешения проблем предтрансфузионного иммуногематологического тестирования // Гематология и трансфузиология. – 2019. –Т. 64, № 2. – С. 222–233.
- Пашкова И.А., Можейко М.П., Арсенова Е.Ю., Минеева Н.В. Отсроченные гемолитические трансфузионные осложнения // Гематология и трансфузиология. — 2009. – № 2. – С. 44–46
- Winters J.L., Howard D.S. Red blood cell antigen changes in malignancy: Case report and review. // Immunohematology. – 2001. – Vol. 17, № 1. – P. 1-9
- Garratty G. Blood groups and disease: A historical perspective. // Transfus Med Rev. –2000. – Vol. 14, № 4. – P. 291-301
- Кробинец И.И., Минеева Н.В., Сысоева Е.А., Чечеткин А.В. Особенности интерпретации результатов исследований антигенов и антител АВО и Резус у пациентов с гематологическими заболеваниями // Сибирский научный медицинский журнал. – 2020. – Т. 40, № 5. – С. 66–72.
- Минеева Н. В., И. А. Пашкова, И. И. Кробинец, Е. А. Сысоева. Аллосенсибилизация к антигенам эритроцитов (обзор литературы) // Иммуногематология. – 2015. –Т. 10, № 4. – С. 60-65.
- Каландаров Р.С., Головкина Л.Л., Васильева М.Н., Стремоухова A.Г., Пушкина Т.Д., Атрощенко Г.В., Паровичникова Е.Н. Генотипирование групп крови систем AB0 и резус у пациентов после множественных гемотрансфузий // Онкогематология. – 2017. – Т. 12, № 2. – С. 70-79.
- Belsito A., Costa D., Fioritoet C., De Iorio G., Casamassimi A., Perrotta S., Napoli C. Erythrocyte genotyping for transfusion-dependent patients at the Azienda Universitaria Policlinico of Naples // Transfusion and Apheresis Sci. – 2015. – Vol. 52, – P. 72-77.
- Castilho L., Rios M., Bianco C., Pellegrino J.Jr., Alberto F.L., Saad S.T.O., Costa F.F. DNA-based typing of blood groups for the management of multiply-transfused sickle cell disease patients // Transfusion. – 2002. – Vol. 42, P. 232-238.
- Дубняк Д.С., Рисинская Н.В., Дроков М.Ю., Судариков А.Б. Мониторинг химеризма после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток // Трансплантология. – 2022. – Т. 14, № 4. – С. 488-498.
- Каландаров Р.С., Головкина Л.Л. Группы крови и онкологические заболевания // Гематология и трансфузиология. – 2021. – Т. 66, № 3. –С. 417-423.
