Анализ эффективности применения молекулярно-генетического типирования для определения фенотипа пациентам с химеризмом по антигенам эритроцитов системы резус
Автор: Гавровская С.В., Сысоева Е.А., Минеева Н.В., Бессмельцев С.С.
Журнал: Вестник гематологии @bulletin-of-hematology
Рубрика: Оригинальные статьи
Статья в выпуске: 4 т.19, 2023 года.
Бесплатный доступ
В терапии гематологических заболеваний широко используются трансфузии компонентов крови, как единичные, так и многократные. Трансфузии донорских эритроцитов не всегда проводятся «фенотип в фенотип», что впоследствии приводит к выявлению двойных популяций (химер) эритроцитарных антигенов в крови реципиента при определении фенотипа методом агглютинации в геле. Недостоверные результаты определения антигенного состава эритроцитов реципиента могут быть причиной ошибок при подборе донорских эритроцитов, что может привести к аллоиммунизации. При следующих трансфузиях растет риск посттрансфузионных осложнений гемолитического типа. Решением проблемы может быть применение молекулярного- генетического типирования для точного определения антигенного состава эритроцитов реципиента. Цель исследования – использовать молекулярно- генетическое типирование для определения анти- генов эритроцитов пациентам с трансфузионным химеризмом для предотвращения ошибок при под- боре донорских эритроцитов. Проанализировать встречаемость двойных популяций (химер) после трансфузионной терапии донорскими эритроцита- ми, подобранными с учетом генотипа реципиента. За 2019-2022 гг. методом агглютинации в геле из 1737 первично госпитализированных лиц с гематологическими заболеваниями у 129 (7,4%) пациентов были выявлены двойные популяции (химеры) по антигенам эритроцитов С, с, Е, е. Эти пациенты были генотипированы, несоответствие результатов молекулярно-генетического метода и метода агглютинации в геле составило 66 случаев (51,2%). Транс- фузии эритроцитов пациентам исследуемой группы проводились с учетом генотипа. При последующих госпитализациях в 2020 – 2021 – 2022 г.г. количество пациентов с химеризмом в группе обследуемых снижалось соответственно 77,8 – 50,0 – 36,0 %. Аллоантитела не были обнаружены ни у одного из 129 пациентов. Молекулярно-генетическое типирование позволило получить достоверный результат. Отсутствие двойных популяций и аллоантител при повторных госпитализациях пациентов доказывает эффективность применения молекулярно-генетических методов при подборе донорских эритроцитов для трансфузий.
Антигены эритроцитов, фенотип, трансфузии, химеризм
Короткий адрес: https://sciup.org/170199870
IDR: 170199870
Текст научной статьи Анализ эффективности применения молекулярно-генетического типирования для определения фенотипа пациентам с химеризмом по антигенам эритроцитов системы резус
Материалы и методы. Было выполнено серологическое типирование 1737 первично госпитализированных пациентов с различными гематологическими заболеваниями, проходивших лечение в ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства». Типирование проводили методом агглютинации в геле в ID-картах DiaClon Rh-Subgroups+K в соответствии с инструкциями производителя (BIO-RAD, Швейцария). Характер агглютинации оценивали в интервале от 1+ до 4+. У 129 лиц были выявлены двойные популяции (химеры) по одному или нескольким антигенам эритроцитов системы Резус С, с, Е, е. что явилось критерием отбора образцов для молекулярно-генетического типирования.
Генетические исследования проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием молекулярной системы детекции на анализаторе FluoVista (Inno-Train, Германия) с помощью аллель-специфических праймеров – SSP ПЦР (SSP: «Sequence Specific Priming»). Аллели генов RHD и RHCE, опосредующие антигенные свойства эритроцитов, определяли с использованием набора реактивов RBC-FluoGene vERYfy (Inno-Train, Германия). Набор позволяет определять 1, 5, 10 экзоны и psi (инсерция внутри 4-ого экзона) гена RHD, а также аллельные варианты гена RHCE.
Выделение геномной ДНК осуществляли с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-В» (AmpliSens, Россия) из цельной крови, взятой в пробирку с 5% К2ЭДТА. Для ПЦР использовали раствор ДНК в концентрации 1 нг/мкл.
Для достоверности различий встречаемости применяли непараметрический статистический метод для малых групп с использованием двухстороннего точного критерия Фишера. Различия рассматривали как статистически значимые при p <0,05.
Все обследованные пациенты подписали информированное согласие. Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России (протокол № 48 от 20.10.2022 г.).
Результаты и обсуждение. В течение 2019 – 2022 гг. проводился мониторинг выявления двойных популяций (химеризма) при исследовании антигенов эритроцитов серологическими методами у пациентов с разными гематологическими заболеваниями.
Из 1737 первично госпитализированных лиц у 129 (7,4%) методом агглютинации в геле были выявлены двойные популяции (химеры) по одному или нескольким антигенам эритроцитов системы Резус
(С, с, Е, е). В таблице 1 показан % встречаемости химеризма среди пациентов с разными гематологическими заболеваниями, нуждающихся в трансфузиях гемокомпонентов.
Таблица 1
Встречаемость химеризма в исследуемой группе по нозологии.
Диагноз |
Пациенты с химерами |
% |
Миелодиспластический синдром |
36 |
29,7 |
Острый лейкоз |
32 |
24,8 |
Хронический миелолейкоз |
18 |
14,0 |
Первичный миелофиброз |
11 |
8,5 |
Хронический лимфоцитарный лейкоз |
10 |
7,8 |
Множественная миелома |
9 |
7,0 |
Апластическая анемия |
7 |
5,4 |
Эссенциальная тромбоцитемия |
3 |
2,3 |
Макроглобулинемия Вальденстрема |
1 |
0,8 |
Неходжинская лимфома |
1 |
0,8 |
Истинная полицитемия |
1 |
0,8 |
Чаще всего двойные популяции антигенов выявлялись у пациентов с миелодиспластическим синдромом (29,7%), острым лейкозом (24,8%) и хроническим миелолейкозом (14,0%). Реже двойные популяции антигенов обнаруживались у пациентов с первичным миелофиброзом, хроническим лимфоцитарных лейкозом, апластической анемией и множественной миеломой. Среди пациентов с другими нарушениями кроветворной системы «химеризм» наблюдался в 0,8 – 2,3% случаев.
При генотипировании пациентов с выявленным химеризмом было получено несоответствие результатов молекулярно-генетического метода и метода агглютинации в геле. Результаты отображены в таблице 2.
Таблица 2
Расхождение результатов серологического и молекулярно-генетического типирования у пациентов исследуемой группы
Антигены, по которым выявлено расхождение |
Количество случаев, n |
Несоответствие фенотип/генотип (n) |
C |
14 |
CхcDEe / ccDEe (10) |
CхcDee / ccDee (3) |
||
Cхcddee / ccddee (1) |
||
E |
22 |
CcDEхe / CcDee (21) |
ссDЕхe / ccDee (1) |
||
c |
15 |
CcхDee / CCDee (14) |
Ccхddee / CCddee (1) |
||
e |
4 |
ссDEех / ccDЕЕ (4) |
сЕ |
5 |
CcхDЕхe / CCDee (5) |
CE |
3 |
CхcDEхe / ccDee (3) |
Се |
3 |
CхcDEeх / ccDЕЕ (3) |
Примечание: нижний индекс «х» справа от буквенного обозначения антигена означает наличие двойной популяции при исследовании методом агглютинации в геле.
По одному антигену системы Rh расхождения наблюдались у 55 пациентов, по двум антигенам у 11. Всего 66 случаев из 129 (51,2%). Чаще встречались расхождения результатов определения антигенов С и Е, иммуногенность которых достаточно высока. Аллоантитела к антигену Е встречаются в 7%, анти-С антитела в 3% несовместимых трансфузий [7]. Причиной значительного количества недостоверных результатов определения фенотипа серологическим методом было наличие в крови пациентов популяций донорских эритроцитов от предыдущих трансфузий, неидентичных по антигенам системы Rh. Полученные нами данные согласуются с результатами других исследований, в которых расхождения между результатами генотипирования и фе-нотипирования у пациентов, имеющих в анамнезе трансфузии компонентов крови, колебались от 10% до 90% [8–10].
Все последующие гемотрансфузии пациенты исследуемой группы получали с учетом генотипа. Гемолитических реакций и осложнений зафиксировано не было. При повторных госпитализациях пациентам проводили фенотипирование методом агглютинации в геле, а также исследование плазмы крови на наличие антиэритроцитарных аллоанти-тел. Аллоантитела не были обнаружены ни у одного из этих больных. Мониторинг госпитализаций пациентов исследуемой группы за 2020 – 2022 годы показал, что повторяемость химеризма последовательно снижалась (Таблица 3).
Таблица 3
Количество повторно госпитализированных генотипированных пациентов с двойными популяциями эритроцитов
Год |
Повторно госпитализировано |
С двойными популяциями эритроцитов |
2020 |
27 |
21 (77,8%) |
2021 |
20 |
10 (50%) |
2022 |
14 |
5 (36%) |
По сравнению с 2020 г. в 2021 г. наметилась тенденция снижения количества таких пациентов (p=0,065), а в 2022 г. химеры встречались достоверно реже (p=0,015).
Двойные популяции эритроцитов встречаются не только у пациентов с множественными трансфузиями в анамнезе. После трансплантации костного мозга у пациентов наблюдается период смешанного гемопоэтического химеризма [11]. Молекулярно-генетический анализ позволяет оценить успешность приживления трансплантата, риск возможного его отторжения, рецидива и т.д. В случае присутствия алло- или аутоантител в крови пациента анализ методом агглютинации в геле также может быть затруднен [2,5,7,12]. При целом ряде заболеваний (лейкозы, пернициозная анемия, общая инфекция, цирроз печени, пневмония, нефрозо-нефрит, болезнь Рейно и др.) может наблюдаться и явление неспецифической агглютинации: сыворотка дает агглютинацию со всеми эритроцитами и даже с собственными, а эритроциты вызывают агглютинацию со всеми сыворотками и даже с сывороткой четвертой группы [7]. В таких случаях молекулярно-генетическое типирование можно рассматривать как альтернативный метод определения антигенного состава эритроцитов.
Выводы
-
1. Молекулярно-генетическое типирование антигенного состава эритроцитов реципиентов с трансфузионным химеризмом позволило получить до-
- стоверный результат.
-
2. Снижение количества пациентов с двойными популяциями и отсутствие аллоантител при повторных госпитализациях пациентов доказывает эффективность применения молекулярно-генетических методов при подборе донорских эритроцитов для трансфузий.
-
3. Проведение генотипирования может быть рекомендовано пациентам с множественными трансфузиями в анамнезе; имеющим антитела к антигенам эритроцитов; после трансплантации костного мозга и в других сложных случаях.
Список литературы Анализ эффективности применения молекулярно-генетического типирования для определения фенотипа пациентам с химеризмом по антигенам эритроцитов системы резус
- Bakanay S.M., Ozturk A., Ileri T. et al. Blood group genotyping in multi-transfused patients // Transfusion and Apheresis Science. – 2013. – Vol. 48, – P. 257–261.
- Пашкова И.А. Алгоритм разрешения проблем предтрансфузионного иммуногематологического тестирования // Гематология и трансфузиология. – 2019. –Т. 64, № 2. – С. 222–233.
- Пашкова И.А., Можейко М.П., Арсенова Е.Ю., Минеева Н.В. Отсроченные гемолитические трансфузионные осложнения // Гематология и трансфузиология. — 2009. – № 2. – С. 44–46
- Winters J.L., Howard D.S. Red blood cell antigen changes in malignancy: Case report and review. // Immunohematology. – 2001. – Vol. 17, № 1. – P. 1-9
- Garratty G. Blood groups and disease: A historical perspective. // Transfus Med Rev. –2000. – Vol. 14, № 4. – P. 291-301
- Кробинец И.И., Минеева Н.В., Сысоева Е.А., Чечеткин А.В. Особенности интерпретации результатов исследований антигенов и антител АВО и Резус у пациентов с гематологическими заболеваниями // Сибирский научный медицинский журнал. – 2020. – Т. 40, № 5. – С. 66–72.
- Минеева Н. В., И. А. Пашкова, И. И. Кробинец, Е. А. Сысоева. Аллосенсибилизация к антигенам эритроцитов (обзор литературы) // Иммуногематология. – 2015. –Т. 10, № 4. – С. 60-65.
- Каландаров Р.С., Головкина Л.Л., Васильева М.Н., Стремоухова A.Г., Пушкина Т.Д., Атрощенко Г.В., Паровичникова Е.Н. Генотипирование групп крови систем AB0 и резус у пациентов после множественных гемотрансфузий // Онкогематология. – 2017. – Т. 12, № 2. – С. 70-79.
- Belsito A., Costa D., Fioritoet C., De Iorio G., Casamassimi A., Perrotta S., Napoli C. Erythrocyte genotyping for transfusion-dependent patients at the Azienda Universitaria Policlinico of Naples // Transfusion and Apheresis Sci. – 2015. – Vol. 52, – P. 72-77.
- Castilho L., Rios M., Bianco C., Pellegrino J.Jr., Alberto F.L., Saad S.T.O., Costa F.F. DNA-based typing of blood groups for the management of multiply-transfused sickle cell disease patients // Transfusion. – 2002. – Vol. 42, P. 232-238.
- Дубняк Д.С., Рисинская Н.В., Дроков М.Ю., Судариков А.Б. Мониторинг химеризма после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток // Трансплантология. – 2022. – Т. 14, № 4. – С. 488-498.
- Каландаров Р.С., Головкина Л.Л. Группы крови и онкологические заболевания // Гематология и трансфузиология. – 2021. – Т. 66, № 3. –С. 417-423.