Анализ содержания эфирных масел и пигментов в хвое Pinus sylvestris L. в условиях породного отвала угольного разреза

Горнодобывающая промышленность в Кузбассе приводит к сокращению природных ресурсов в результате деградации растительного покрова. Для предотвращения истощения природных ресурсов, особенно лекарственного назначения, необходимо их тщательное изучение, рациональное и комплексное использование, поиски новых источников. В связи с этим, актуальной становится проблема поиска дополнительного ресурсно-сырьевого потенциала лекарственных растений и изучение особенностей накопления в них биологически активных веществ.

В последние годы большое внимание ученые и медики уделяют изучению природы биологической активности отдельных компонентов растительного сырья и механизмов их воздействия на живой организм. К наиболее важному классу биологически активных соединений относятся эфирные масла и пигментный комплекс. Они являются активными метаболитами обменных процессов, протекающих в растительном организме. Эфирные масла – сложная смесь терпеновых углеводородов и их производных, продуцируемых в условиях жизнедеятельности самого растения [7]. Они способствуют предохранению растения от чрезмерного нагревания днем и переохлаждения ночью, а также участвуют в регуляции транспирации. Наиболее богатый компонентный состав имеет эфирное масло из сосновой хвои, который включает монотерпены (75,3%), сесквитерпены (15,8%), кислородсодержащие соединения (8,3%), кислоты (0,4%), фенолы (0,1%). Основными компонентами эфирного масла сосны являются α- и

β-пинен, камфен, сабинен, лимонен, 3-карен, α- и β-фелландрен, мирцен, оцимен, туйен, камфора, кариофиллен, борнилацетат [6, 13]. По мнению ряда авторов, содержание пигментов является показателем потенциальной фотосинтетической способности растений и служит индикатором общего состояния растительного организма, кроме того, вытяжка хлорофиллов используется в фармакологии [5, 8, 11, 12]. В связи с широким использованием Pinus sylvestris L. для рекультивации породных отвалов, она является ресурсной базой для получения хозяйственно ценных веществ, в частности эфирных масел и пигментов. В литературе недостаточно сведений о содержании биологически активных соединений у хвойных пород деревьев, произрастающих на техногенно измененных территориях, поэтому работа является актуальной.

Цель нашей работы – анализ содержания эфирных масел и пигментов в хвое Pinus sylvestris L. в условиях породного отвала угольного разреза «Кедровский». В задачу исследований входило изучение фракционного состава эфирных масел и количественного содержания пигментного комплекса (сумма хлорофиллов ( Х ) (а+b) , сумма каротиноидов ( К ), соотношение ( Х/К ) хвои сосны обыкновенной.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены на базе Института экологии СО РАН и НИОХ СО РАН. Объектом исследования служила Pinus sylvestris L. 10-15 летнего возраста. Площадки наблюдений (ПН) выбраны на породном отвале угольного разреза «Кедровский»: ПН1 – спланированный отвал с нанесением потенциального плодородного слоя почвы (ППС), ПН2 – межотвальная впадина без нанесения ППС, ПН3 – спланированный отвал без нанесения ППС. Возраст отвала 30 лет, в 2004 г. проведен комплекс работ по его планировке. Породы отвала представлены песчаником (60%), алевролитами (20%), аргиллитами (15%), суглин- ками и глинами (5%). По агрохимическим показателям эмбриоземы всех площадок характеризуются высокой обеспеченностью обменным калием (100…240 мг/кг) и низкой обеспеченностью подвижным фосфором (10…50 мг/кг). На ПН1 и ПН2 отмечена средняя обеспеченность нитратным азотом (9,5…13,8 мг/кг). Эмбриоземы ПН3 характеризовались самыми низкими значениями обменного фосфора и нитратного азота (10…20 и 3,6…6,0 мг/кг соответственно).

Подготовка образцов для анализа. Анализируемую смесь (1-10мкл) растворяли в 500 мкл ацетона, к полученному раствору добавляли 100 мкл гексанового раствора смеси, содержащей равные весовые количества нормальных углеводородов C8, C9 …С24 суммарной концентрации 0,1%. Хромато-масс-спектрограммы регистрировались на приборах Agilent 5973N (НИОХ СО РАН) и Agilent 5973N EI/PCI (Факультет естественных наук, Новосибирский государственный университет). Разделение компонентов исследуемых эфирных масел проводили на газовых хроматографах серии Agilent 6890, входящих в состав упомянутых хромато-масс-спектрометрических систем. Разделение осуществляли на кварцевой капиллярной колонке HP-5ms длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм, неподвижная фаза – сополимер 5%-дифенил-95%-диметилсилоксан, толщина пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Температура испарителя – 280ºС, объем пробы – 1 мкл, разделение потока 100:1. Температурный режим колонки: 50ºС (2 мин) – 50-240ºС (4 º/мин) – 240-280ºС (20 º/мин) – 280ºС (5 мин).

Газ-носитель – гелий с постоянным потоком 1 мл/мин. Температура интерфейса между хроматографом и масс-селективным детектором – 280ºС. Масс-спектры регистрировались на квадрупольном масс-спектрометре HP MSD 5971 при ионизации электронным ударом с энергией ионизирующих электронов 70 эВ. Данные собирались со скоростью 1,9 скан./сек в диапозоне 30-650 а.е.м. (Agilent 5973N) или 3 скан./сек в диапозоне области 29-500 а.е.м. (Agilent 5973N EI/PCI). Задержка между вводом пробы в испаритель хроматографа и началом записи хромато-масс-спектрограммы составляла 3,0 мин. Вычисление линейных индексов удерживания J_x проводили по формуле:

t R _x – t R _n

Jx = Jn + 100k , tR(n+k) – tRn где Jn = 100n – индекс удерживания н-алкана, содержащего в молекуле n атомов углерода; tR – абсолютные времена удерживания компонентов; tx – время удерживания исследуемого вещества; tn и t(n+k) – времена удерживания ближайших реперных н-алканов, с числом атомов углерода соот- ветственно n и n+k, причем обычно tn < tx

Содержание фотосинтетических пигментов (сумма хлорофиллов (Х) (а+b), сумма каротиноидов (К), соотношение (Х/К) в хвое сосны определяли спектрофотометрическим методом (с использованием спектрофотометра LEKI SS 1207) в трехкратной повторности и рассчитывали по формулам Mac-Kinney и Wettstein [1]. Статистический анализ данных выполнен с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1 и Microsoft Οffice Excel 2007. Критическое значение уровня статистической значимости принималось равным 0,05. Описание количественных признаков в исследованных площадках наблюдений производилось с использованием средних арифметических и среднеквадратических (стандартных) ошибок среднего (М±m, где М – среднее, а m – ошибка среднего), среднеквадратических отклонений (σ_x) и коэффициента вариации (v, %).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ результатов хромато-масс-спектрометрического исследования хвои Pinus sylvestris L. показал, что в состав эфирных масел входит 59 компонентов, из них идентифицированы представители терпенов и терпеноидов, причем преимущество (37 компонентов) принадлежит соединениям первого класса (табл. 1).

Доминирование терпенов (монотерпенов и сесквитерпенов), наблюдаемых в нашем исследовании, согласуются с работами других авторов [10]. По литературным сведениям, монотерпеновая фракция эфирного масла, подавляющего большинства видов сосен, полученная из любого типа сырья (хвои, коры, древесины) одинаковая и включает в себя основные компоненты – α- и β-пинен, Δ3-карен, лимонен и β-фелландрен [9]. Но количественное соотношение этих компонентов меняется и зависит от типа сырья, из которого извлечено масло, так и от типа сосны. На соотношение компонентов эфирного масла оказывают влияние и другие факторы: погодные условия вегетации растения, плодородие почвы на месте произрастания, северная или южная сторона дерева (освещенность кроны) и др.

Наши эксперименты и работы других авторов [7, 10] подтверждают высказывания о том, что одними из наиболее распространенных соединений в сосне обыкновенной являются пинены (α- и в-пинен) и А3-карен. Из монотерпенов инден-тифицировано 14 соединений, из них наибольшее количество составили а-пинен (10,28-15,11%), А3-карен (7,11-7,57%), камфен (1,42-2,22%), в-пинен (1,19-1,72%), в-мирцен (0,58-0,68%).

Нами отмечено, что в эфирном масле доля монотерпеновой фракции уменьшалась, а сескви-терпеноидов - увеличивалась. На фоне общего уменьшения монотерпенов количество а-пинена повышалось, что связано с биологической активной защитной функцией данного соединения для сосны. Доля А3-карена в эфирном масле уменьшалась, что обусловлено в значительной мере его окислением. Некоторые исследователи отмечают взаимопротивоположную динамику изменения количества а-пинена и А3-карена - при увеличении первого соединения уменьшается количество второго [3]. Нами выявлено, что в масле хвои сосны обыкновенной на исследуемых площадках доля а-пинена преобладала над А3-кареном в 2,52,9 раза.

Таблица 1. Результаты хромато-масс-спектрометрического исследования хвои Pinus sylvestris L.

Примечание: Символ «+» означает, что соответствующий компонент присутствует, но его содержание не превышает 0,05%; «-» - соединение отсутствует.

Из сесквитерпеновых соединений идентифицировано 23 соединения. В количественном отношении преобладающими сесквитерпенами в растительных образцах относятся 5-кадинен+транс-каламенен (5,31-15,23%), у-кадинен (4,69-8,82%), кариофиллен (2,61-3,01%), гермакрен D (1,06-6,35%), 4-эпи-кубебол+бициклогермакрен (2,37-5,71%), а- и у-муролен (1,08-2,39%) и в-селинен (0,87-1,91%), остальные компоненты этого класса встречаются в небольших количествах. Их соединений класса терпеноидов в опытных образцах выявлено 22 компонента, среди них обнаружены спиртосодержащие соединения, эфиры, альдегиды и кетоны. Наибольшее содержание отмечено по Т-кадинолу+Т-мурололу (5,78-6,42%), а-кадинолу (5,47-7,24%), гермакрену D-4-ол+спатуленолу (4,54-6,28%) и борнилацетату (0,54-2,67%).

Уровень накопления компонентов эфирного масла в исследованных растительных образцах имеет некоторые отличия на различных площадках наблюдений. Однако качественный состав образцов вне зависимости от места произрастания остается однотипным (за исключением некоторых компонентов), а изменяется только количественное содержание доминирующих веществ, что может свидетельствовать о генетически закрепленном свойстве исследованных хвойных образцов синтезировать определенный набор органических соединений. Наибольшее количество летучих соединений выявлено у хвойных образцов на спланированном отвале без нанесения ППС (ПН3) (91,64%), по сравнению с другими площадками наблюдений (ПН2 - 86,31%, ПН3 - 85,51%). Установлено, что по количественному содержанию сесквитерпенов доминировали образцы с третьей площадки наблюдений и превышали другие исследуемые площадки на 18% (ПН1) и 15% (ПН2), а по количеству монотерпенов и терпеноидов -образцы с первой площадки наблюдений на 1316% и 11-29% соответственно.

Количественные характеристики пигментного комплекса хвои сосны показали, что концентрация суммы хлорофиллов и каротиноидов изменялась от минимальных значений в июне (0,28-1,17 мг/г) до максимальных - в июле (0,34-1,30 мг/г), с последующим снижением - в августе (0,31-1,10 мг/г). Выявлено, что у Pinus sylvestris L. количе- ственное содержание зеленых пигментов в хвое превышало количество желтых в 2,3 раза. Наши исследования согласуются с работами других авторов. Так, в работе А.А. Кулагина [2] отмечено увеличение содержания пигментов в хвое сосны обыкновенной на отвалах Кумертуского буроугольного разреза, в первой половине лета, причем максимум приходится на июль, при этом сумма хлорофиллов всегда больше количества каротиноидов.

Сравнительная характеристика концентраций фотосинтетических пигментов в хвое сосны показала некоторые отличия на исследуемых площадках. Для растений характерны максимальные значения суммы хлорофиллов и каротиноидов, произрастающих на спланированном отвале без нанесения ППС. Так, на участке ПН3 концентрация суммы хлорофиллов составила 1,19 мг/г, что выше на 44 и 4%, чем на ПН1 и ПН2, а сумма каротиноидов превысила другие ПН на 39 и 8% соответственно (табл. 2).

Таблица 2. Содержание пигментного комплекса в хвое Pinus sylvestris L. и средние статистические показатели на исследуемых площадках наблюдений

Отношение количества хлорофиллов к содержанию каротиноидов в хвое характеризует общее состояние ассимиляционного аппарата сосны обыкновенной. Низкий уровень данного показателя свидетельствует о дисбалансе между основной и вспомогательной формами пигментов. Анализ полученных данных выявил, что соотношение пигментов Х/К хвои сосны незначительно различался на всех площадках наблюдений и варьировал в пределах от 2,16 до 2,43. Полученные результаты показали, что данный показатель достаточно стабилен и колебания параметра слабо зависит от экологических условий места произрастания сосновых насаждений. Корреляционный анализ показал, что уровень накопления каротиноидов в хвое сосны обыкновенной на исследуемых площадках тесно коррелировал с содержанием хлорофиллов (r=+0,74, при p<0,05, n=135).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В хвое Pinus sylvestris L., произрастающей в условиях породного отвала угольного разреза «Кедровский», идентифицировано 57 компонентов в составе эфирного масла, причем наибольшее накопление принадлежит терпеновым соединениям. Выявлено, что максимум накопления пигментного комплекса в хвое сосны приходится на июль. В течение вегетации количественное содержание хлорофиллов превышало количество каротиноидов в 2,3 раза.

На спланированном отвале (ПН3) без нанесения потенциально плодородного слоя почвы накопление фотосинтетических пигментов и количество летучих соединений, особенно сесквитерпенов, выше, чем на других площадках наблюдений (ПН1 и ПН2), что можно рассматривать как адаптивную реакцию к неблагоприятным эдафи-ческим условиям.

Результаты исследований показали, что хвоя Pinus sylvestris L., несмотря на неблагоприятные эдафические условия, богата эфирными маслами и пигментами. Для возможности использования хвои сосны, произрастающей на техногенно нарушенных территориях, необходимы дальнейшие исследования эколого-гигиенической безопасности сырья.