Анализ стабильности качества фитогенной эмульсии на основе эфирного масла в процессе хранения

Профилактика и лечение заболеваний разной этиологии — одни из важных задач в животноводстве и птицеводстве (1). В связи с принятым ВОЗ ограничением на использование антибиотиков в этой сфере ведется активный поиск их альтернативной замены натуральными фитобиотиками (2-5). Среди биологически активных веществ особое место принадлежит эфирным маслам, большинство из которых обладает антимикробным и иммуностимулирующим действием (6-9).

При выращивании молодняка крупного рогатого скота серьезные проблемы возникают в послеотъемный период. При переводе телят на заменитель цельного молока высок риск развития абомазоэнтерита, что может повлечь гибель (1). В литературе имеются данные об использовании в качестве добавки в корм телят фитобиотиков, в том числе эфирных масел. Так, при добавлении в корм телят голштинской породы смеси эфирных масел, содержащих в своем составе карвакрол, кариофиллен, p-цимен, цинеол, терпинен и тимол, и пребиотиков в дозе 1,25 г существенно повышался прирост живой массы и улучшался ряд физиологических показателей (10). К аналогичному выводу пришли Т. Liu с соавт. (11). В возрасте 70 сут у телят, получавших добавку с эфирным маслом, частота возникновения легкой диареи (балл 4) была в 3,5 раза ниже, а тяжелой (балл 5) — вдвое ниже, чем у телят контрольной группы. Также наблюдалось увеличение показателей экстерьерного профиля.

В большинстве случаев в качестве фитобиотика используется сложная смесь растительных компонентов, в том числе эфирных масел, или смесь только эфирных масел (10, 11). При введении таких фитобиотиков в сельскохозяйственную практику следует учитывать необходимость наличия постоянного источника (производителя) эфирных масел и/или всех компонентов, обеспечивающего их соответствие действующим стандартам, независимо от изменчивости био- и абиотических факторов (погодно-климатические условия, технология переработки растительного сырья и т.д.) (8). Следует уточнить, что стандартами допускается изменчивость содержания компонентов в эфирном масле в определенных пределах. Необходимость расчета количества каждого составляющего для приготовления многокомпонентного препарата с установленным содержанием действующих веществ существенно усложняет весь процесс и увеличивает его стоимость. Кроме того, высокая цена эфирных масел, а тем более их чистых компонентов также обусловливает высокую стоимость таких кормовых добавок, огранивая их использование в широкой сельскохозяйственной практике.

Наши предыдущие исследования были направлены на разработку фитогенных добавок с малым количеством компонентов. Анализ существующих данных об эффективности эфирных масел, а также их экономической и производственной доступности позволил остановить выбор на эфирных маслах кориандра посевного (Coriandrum sativum L.) и фенхеля обыкновенного (Foeniculum vulgare Mill.), которые характеризуются широким спектром биологической активности, включая антибиотические, иммунмодулирующие, антиоксидантные свойства, в том числе регуляцию обменных процессов в организме (12). В литературе имеются сведения об использовании эфирных масел этих культур в качестве фитогенных добавок в животноводстве и птицеводстве (8, 13-15). Площади кориандра посевного составляют до 90 % от всех площадей, занятых эфиромасличными культурами в России. Также достаточно распространен фенхель обыкновенный (12). Это свидетельствует о потенциальной возможности получения эфирных масел в количествах, достаточных для приготовления экономически выгодных партий фитогенного препарата.

Результаты наших исследований по использованию эфирных масел кориандра посевного и фенхеля обыкновенного как фитогенных добавок в заменитель цельного молока для телят-молочников черно-пестрой породы показали усиление неспецифической резистентности, а также улучшение физиологических и биохимических процессов в организме животных (16, 17). Однако при введении эфирного масла в чистом виде в заменитель цельного молока оно, будучи гидрофобным, не распределялось в нем равномерно, а концентрировалось на поверхности и оседало на стенках сосуда. Решением такой проблемы стало создание фитогенной липосомальной эмульсии, содержащей эфирное масло и способной равномерно распределяться в жидкой среде (3, 13, 18). Мы разработали способ получения малокомпонентной фитогенной липосомальной эмульсии, эффективность которой была подтверждена результатами собственных исследований. Установлено положительное влияние фитогенной добавки на формирование микробиома рубца теленка. По данным анализа T-RFLP, в рубце 2-месячных телят наблюдалось значительное увеличение целлюлозолитических бактерий. В опытной группе при использовании эмульсии их количество почти вдвое (р <  0,05) превышало таковое у контрольных телят (19).

Предусматривая возможность внедрения разрабатываемой методики использования фитогенных липосомальных эмульсий на основе эфирных масел в сельскохозяйственную практику, в частности для выращивания молодняка крупного рогатого скота, следует учесть, что препарат должен готовиться заблаговременно и храниться как минимум до полугода, поскольку появление телят не может быть одновременным в хозяйствах разных регионов. Использовать такой препарат следует на протяжении всего периода выкармливания телят заменителем цельного молока (2,5-3 мес).

Отметим, что в источниках литературы мы не нашли информации о сроках хранения и стабильности состава фитогенных липосомальных эмульсий, используемых в разных исследованиях.

В настоящей работе впервые приведены данные об эффективности использования липосомальной эмульсии, содержащей эфирное масло, в качестве фитогенной добавки в заменитель цельного молока для телят в молочный период кормления.

Нашей целью было изучение стабильности фитогенной липосомальной эмульсии по количеству и компонентному составу содержащегося в ней эфирного масла в процессе хранения и оценка действия фитоэмульсии на иммунную систему телят в молочный период.

Методика. Материалом для исследования были два варианта фитогенных липосомальных эмульсий (эмульгатор — соевый лецитин): эмульсия, содержащая эфирное масло кориандра посевного, и эмульсия с эфирным маслом фенхеля обыкновенного. Содержание эфирного масла в эмульсии составляло 10 % от общей массы. Для производства использовали эфирные масла из товарных плодов этих культур, выращенных в селекционно-семеноводческом центре эфиромасличных культур ФГБУН НИИ сель-532

ского хозяйства Крыма (НИИСХ Крыма). Климат региона умеренно-континентальный. Территория относится к одному из пяти агроклиматических районов — верхнему предгорному, теплому, недостаточно влажному (северный подрайон с умеренно мягкой зимой).

Эфирные масла были получены в лабораторных условиях из товарных плодов обеих культур по Клевенджеру согласно методике биохимических исследований (12, 20). Характеристика эфирных масел соответствовала стандартным требованиям — ГОСТ ISO 3516-2018 ; ГОСТ 3902-82 .

Эмульсии были приготовлены 1-2 сентября 2023 года. В гомогенизаторе высокого давления Донор-5 (ФИЦ ПНЦБИ РАН, Россия) соевый лецитин соединяли с нагретым до 35 ° С физиологическим раствором в соотношении 1:8 и перемешивали со скоростью 30 об/мин до полного растворения, после чего в полученный раствор медленно вносили эфирное масло в количестве, равном количеству лецитина, и перемешивали в течение 15 мин со скоростью 300 об/мин. Затем субстанцию переносили в гомогенизатор высокого давления на 9 мин при 33±3 ° С, рН 6,5-8,0 с постепенным повышением давления от 20 до 40 МПа, до достижения липосомами размера 300±50 нм.

В качестве сырья использовали лецитин соевый («Арт Лайф», Россия), обезжиренный гидролизованный (сухой), порошок (пищевая добавка Е322, представляющая собой фосфолипидную смесь), в состав которого входили различные фосфолипиды (ФЛ): фосфатидилхолин — до 22 %, фосфатидилинозитол — до 17 %, фосфатидилэтаноламин — до 13 %, фосфати-дилсерин — до 10 %, лизофосфатидилхолин — до 5 % и фосфатидная кислота — до 8 %. Из перечисленных фосфолипидов в мембранах клеток наиболее распространен фосфатидилхолин (1,2-диацилглицеро-3-фосфохолин), который способен к легкому самопроизвольному образованию липидного бислоя в водной среде.

Основной средой для приготовления эмульсии служил физиологический раствор, который передает электрический заряд лучше воды, что обеспечивает заряд липосомы и позволяет лучше смешивать с эфирным маслом.

После приготовления эмульсии были разлиты в герметически закрывающиеся градуированные емкости объемом 15 мл и хранились в лабораторных условиях при 20-22 ° С. Анализ содержания и компонентного состава эфирного масла проводили ежемесячно (3-4 числа) на протяжении полугода в 2023-2024 годах в НИИСХ Крыма.

Извлечение эфирного масла из эмульсии осуществляли посредством гидродистилляции по методике Гинзберга (21). Методика разработана для определения содержания эфирного масла в цветочно-травянистом сырье. При анализе эмульсий продолжительность процесса гидродистилляции была установлена опытным путем. Скорость гонки составляла 4,5-5,0 мл/мин (эфирное масло фенхеля) и 5,0-6,0 мл/мин (эфирное масло кориандра); продолжительность гидродистилляции — 90 и 40 мин, соответственно.

Компонентный состав эфирных масел кориандра посевного и фенхеля обыкновенного, как полученных из плодов, так и извлеченных из эмульсий, определяли методом газовой хроматографии на приборе Кристалл 5000.2 с пламенно-ионизационным детектором (ЗАО СКБ «Хрома-тек», Россия). Для идентификации и полного разделения основных компонентов эфирного масла были подобраны следующие условия хроматографирования: колонка капиллярная кварцевая (HP-Innowax, «Agilent Technol- ogies», США) длиной 30 м с внутренним диаметром 0,32 мм и толщиной фазы 0,5 мкм; неподвижная фаза CR-WAXms. Температура термостата колонки программировалась в следующем режиме: 75 °С с выдержкой 1 мин, далее программирование со скоростью изменения 4 °С/мин до 160 °С для кориандра и до 195 °С для фенхеля. Температура инжектора — 230 °С, температура детектора — 250 °С. Газ-носитель — гелий, поток газа-носителя — 1,9 мл/мин, деление потока газа-носителя — 1/20, общее время анализа — 22 мин для кориандра и 31 мин для фенхеля.

Для идентификации основных компонентов эфирных масел кориандра посевного и фенхеля обыкновенного изначально было проведено сопоставление хроматограмм, полученных при анализе одних и тех же образцов эфирных масел одновременно на хромато-масс-спектрометре Agilent Technologies 6890N («Agilent Technologies», США) с масс-селективным детектором Agilent 5973N («Agilent Technologies», США) и на хроматографе Кристалл 5000.2 при одинаковых условиях хроматографирования. При анализе на хромато-масс-спектрометре выполняли сравнение полных масс-спектров компонентов пробы и соответствующих данных для чистых веществ в специализированных библиотеках NIST и Wiley 2007 с программами для идентификации AMDIS и NIST (22, 23). Процентное содержание компонентов в пробе рассчитывали методом внутренней нормализации по площади пиков без использования корректирующих коэффициентов. Дополнительно проводили идентификацию компонентов посредством сравнения их индексов удерживания по Ковачу с данными литературы. Индексы удерживания Ковача определяли по отношению к гомологическому ряду н-алканов (C 8 -C 40 ) в тех же рабочих условия (22, 23).

Был проведен микробиологический анализ эмульсий на выявление микрофлоры с использованием общепринятых микробиологических методик (24). Для каждой из двух эмульсий через 4 мес хранения были проанализированы следующие варианты: эмульсия из герметически закрытой пробирки и эмульсия из пробирки, открытой через 3 мес хранения и находившейся в течение 1 мес под марлевым покрытием. Посев образцов эмульсий проводили в трех повторностях на мясопептонный агар (для обнаружения бактерий) и среду Чапека (для обнаружения микроскопических грибов).

Эффективность действия фитоэмульсий оценивали в 2023 году на телятах ( Bos taurus ) черно-пестрой породы молочного периода кормления во Всероссийском НИИ физиологии, биохимии и питания животных. Основной рацион телят состоял из 750 г сухого заменителя цельного молока (ЗЦМ) на 1 гол. в сутки, 150 г стартерного комбикорма на 1 гол. в сутки в качестве прикорма и сена люцернового. Телята содержались в индивидуальных домиках до достижения 3-месячного возраста. Сформировали четыре группы молодняка по 10 гол. в каждой. Животным трех опытных групп с 3-недельного возраста в ЗЦМ вводили кормовой комплекс в виде смеси эмульсий эфирных масел фенхеля и кориандра из расчета 10 мл/гол. В 10 мл эмульсий был 1 мл эфирных масел в разных соотношениях: в I группе — 70/30 % соответственно масла фенхеля обыкновенного и кориандра посевного, во II группе — 50/50 %, в III группе — 30/70 %. Молодняк в IV группе служил контролем и получал только основной рацион (ОР) без добавок. Продолжительность опыта составила 67 сут до 3-месячного возраста животных. В конце опыта у телят брали кровь из яремной вены с использованием вакуумной системы отбора крови Improvacuter («GIMI», Китай).

Для анализа экспрессии генов интерлейкина 6 (IL-6), интерлейкина 8 (IL-8), сиртуина 3 (SIRT3) применяли вариант полимеразной цепной реакции, основанный на регистрации продуктов ПЦР в режиме реального времени. Использовали оригинальные праймеры и ДНК-зонды, обеспечивающие специфическую обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию. Лимфоциты из цельной крови отделяли с помощью набора ПРОБА-ФИКОЛЛ («ДНК-Технология», Россия), тотальную РНК из образцов — РИБО-преп («AmpliSens», ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Согласно инструкции, очищенные РНК помещали в лабораторный холодильник при 2-8 °С на 12 ч. Затем при помощи набора РЕВЕРТА-L («AmpliSens», ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) осуществили реакцию обратной транскрипции и получили кДНК на матрице РНК.

Для оценки профиля экспрессии генов использовали технологию относительного анализа количества мРНК в образцах с помощью реакции обратной транскрипции и последующей ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР в реальном времени). ОТ-ПЦР выполняли в трех повторностях. Концентрацию полученной кДНК измеряли на приборе MAXLIFE Fluorimeter 2.0 с применением набора dsDNA 2.0-500 V2.0 MAXLIFE (ООО «МВМ-Диагно-стик», Россия). ПЦР проводили в 48-луночном планшете АНК-М (Институт аналитического приборостроения РАН, Россия), содержащем, помимо анализируемых образцов, пять стандартов с двукратным разведением, необходимых для оценки качества ПЦР, и отрицательный контроль. Каждый образец, стандарт и отрицательный контроль анализировали в трех технических повторностях. Реакцию амплификации выполняли с помощью набора HS-qPCR SYBR Blue 2х («Биолабмикс», Россия) на анализаторе нуклеиновых кислот АНК-М (Институт аналитического приборостроения РАН, Россия) согласно протоколу производителя. Режим амплификации был следующим: 300 с при 95 ° С (натуральная денатурация); 20 с при 95 ° С (45 циклов) (денатурация); 40 с при 55-56 ° С (45 циклов) (отжиг); 30 с при 72 ° С (45 циклов) (элонгация). Использовали следующие олигонуклеотидные праймеры:

| Ген-мишень | _______________ Пара праймеров _______________|

IL-6	F: R:	5'-CTTCTGCTTTCCCTACCCCG-3' 5' -TTCTGCCAGTGTCTCCTTGC-3'
IL-8	F:	5'-CTCTCTGCAGCTCTGTGTGAA-3'
	R:	5' -GGGTTTAGGCAGACCTCGTTT-3'
SIRT3	F:	5'-GGUGGAGGAUGGUCCAUAUTT-3'
	R:	5' -AUAUGGACCAUCCUCCACCTT-3'
P -Aetin	F:	5'-ATTGTCCACCGCAAATGCTTC-3'
	R:	5' -AAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC-3'

Относительную экспрессию рассчитывали по методу 2 ^{-AA Ct}. Для корректной оценки экспрессии изучаемых генов важен правильный выбор нормировочных генов, поскольку они могут по-разному экспрессироваться в разных тканях и даже в одной ткани. В качестве референсного мы выбрали ген-нормализатор p-Aetin . У крупного рогатого скота активность этого гена постоянна, что позволяет использовать его в качестве стандартного контроля при экспрессии.

При анализе полученных экспериментальных данных рассчитывали средние показатели ( M) с ошибкой средней (±SEM) на 95 % уровне значимости и их процентное отношение к контрольному значению. Достоверность различия средних показателей определяли по критерию Тьюки. Статистическую обработку данных выполняли с использованием пакета программ Microsoft Excel 2010 (25).

Результаты. Для приготовления фитосомальных эмульсий были использованы эфирные масла, полученные из товарных плодов кориандра посевного и фенхеля обыкновенного. При этом учитывали результаты проведенного ранее сравнительного анализа, показавшего соответствие компонентного состава эфирных масел из оригинальных семян кориандра сортов Янтарь, Нектар, Медун и Силач и из смеси товарных плодов этих сортов урожая 2018-2020 годов (в произвольном соотношении), а также из оригинальных семян фенхеля сортов Мэрцишор и Оксамит Крыма и из смеси их товарных плодов тех же лет выращивания (26).

Основные компоненты эфирных масел кориандра посевного и фенхеля обыкновенного — соответственно линалоол (65-78 % согласно ГОСТ ISO 3516-2018) и анетол (не менее 60 % согласно ГОСТ 3902-82). Мы установили, что содержание линалоола в эфирных маслах из оригинальных семян перечисленных сортов кориандра составляло 68,8-71,8 %, из товарных — 70,2 %. Сравнение эфирных масел из оригинальных семян фенхеля и из товарных плодов также показало соответствие содержания анетола требованиям стандарта: 63,7-66,8 % в эфирных маслах из оригинальных семян и 68,1 % — из товарных плодов (26). Следовательно, эфирное масло из товарных плодов этих культур, какое и получают в производстве, не уступает по качеству таковому из оригинальных семян. Содержание в эфирном масле основного компонента может различаться в зависимости от условий выращивания растений в незначительных пределах, но должно соответствовать требованиям стандартов.

Для приготовления эмульсии в настоящей работе использовали эфирное масло кориандра посевного, в котором содержание линалоола составляло 68,15 % (табл. 1). Эфирное масло кориандра посевного включает около 20 компонентов (27). Все компоненты, кроме линалоола, минорные. В наших исследованиях, помимо линалоола, учитывали содержание компонентов, входящих в состав эфирного масла в количестве 2-8 %.

Содержание эфирного масла кориандра посевного в эмульсии на протяжении 6 мес колебалось в небольших пределах, составив в среднем 96 % от количества в свежеприготовленном препарате (1,5 мл). Через 1 мес в эфирном масле из эмульсии отмечали достоверное снижение (р <  0,05) процентного содержания его легколетучих компонентов: а -пинена, Y -тер-пинена, лимонена и камфоры соответственно на 22,5; 8,0; 6,5 и 16,3 %. В последующие месяцы их содержание практически не менялось и составило в среднем 77,2; 88,8; 92,8 и 88,1 % к контролю.

Снижение количества легколетучих компонентов привело к некоторому уменьшению объема эфирного масла. Логично этим объяснить изменение процентного содержания остальных его компонентов. Так, процентное содержание гераниола через 1 мес увеличилось на 19,2 % и незначительно уменьшалось в дальнейшем. На протяжении всего срока хранения его процентное содержание в эмульсии превышало таковое в контроле в среднем на 9,6 %. Процентное содержание основного компонента эфирного масла кориандра — линалоола через 1 мес увеличилось на 4,6 % и затем колебалось в небольших пределах. В течение 6 мес хранения эмульсии за счет уменьшения общего объема эфирного масла процентное содержание линалоола превысило таковое в исходном масле в среднем на 4,9 %. Отличия содержания всех указанных компонентов в эфирном масле из эмульсии от значений в контроле статистически значимы (р <  0,05).

Аналогичные результаты были получены при анализе фитогенной липосомальной эмульсии, содержащей эфирное масло фенхеля обыкновенного. Использованное для приготовления эмульсии эфирное масло фенхеля содержало 69,91 % анетола (табл. 2). Всего в эфирном масле фенхеля обыкновенного насчитывается до 30 компонентов (27).

• 1.    Содержание и компонентный состав эфирного масла из товарных плодов кориандра посевного ( Ñoriandrum sativum L.) в эмульсии в зависимости от продолжительности хранения ( n = 2, M ±SEM; селекционно-семеноводческий центр эфиромасличных культур ФГБУН НИИ сельского хозяйства Крыма, Республика Крым; урожай 2018-2022 годов)

  Срок хранения, мес	Содержание эфирного масла в 15 мл эмульсии, мл	Содержание компонентов, %						Содержание линалоола, мл
  		а-пинен	лимонен	Y —терпинен	камфора	гераниол	линалоол
  Контроль (эфирное масло)		8,08±0,20	2,91±0,01	6,88±0,05	4,05±0,05	2,39±0,02	68,15±0,13	1,022±0,002
  1	1,500±0,003	6,26±0,16*	2,72±0,05*	6,33±0,16*	3,39±0,07*	2,85±0,02*	71,28±0,13*	1,069±0,002*
  2	1,430±0,001	6,25±0,37*	2,67±0,04*	6,15±0,17*	3,41±0,04*	2,87±0,01*	70,92±0,47*	1,014±0,007
  3	1,470±0,002	6,23±0,21*	2,73±0,02*	6,07±0,21*	3,76±0,12*	2,60±0,09*	72,11±0,26*	1,060±0,002*
  4	1,400±0,002	6,22±0,02*	2,88±0,00*	5,85±0,14*	3,68±0,01*	2,58±0,05*	72,25±0,15*	1,012±0,003*
  5	1,420±0,003	6,60±0,16*	2,66±0,10*	6,17±0,09*	3,62±0,06*	2,46±0,02*	71,37±0,17*	1,013±0,003*
  6 Среднее:	1,420±0,002	5,89±0,37*	2,53±0,05*	5,92±0,11*	3,41±0,14*	2,37±0.03*	71,01±0,16*	1,008±0,002*
  за период хранения	1,440±0,020	6,24±0,09*	2,70±0,05*	6,11±0,08*	3,57±0,07*	2,62±0,08*	71,46±0,25*	1,029±0,011
  к контролю, % ____________________ 96,0                   77,2 Примечание. Для линалоола указано содержание в 1,5 мл эфирного масла. * Различия с контролем статистически значимы при р <  0,05.			92,8	88,8	88,1	109,6	104,9	100,7

• 2.    Содержание и компонентный состав эфирного масла из товарных плодов фенхеля обыкновенного ( Foeniculum vulgare Mill.) в эмульсии в зависимости от продолжительности хранения ( n = 2, M ±SEM; селекционно-семеноводческий центр эфиромасличных культур ФГБУН НИИ сельского хозяйства Крыма, Республика Крым; урожай 2018-2022 годов)

Срок хранения, мес		Содержание эфирного масла в 15 мл эмульсии, мл	Содержание компонентов, %						Содержание анетола, мл
			а-пинен	лимонен	фенхон	метилхавикол	анисовый альдегид	анетол
Контроль (эфирное масло)			2,48±0,03	0,15±0,00	13,03±0,04	3,31±0,02	2,22±0,02	69,91±0,30	1,049±0,006
1		1,470±0,001	1,74±0,01*	1,72±0,02*	11,58±0,28*	3,55±0,10*	0,93±0,10*	75,09±0,57*	1,104±0,009*
2		1,440±0,001	1,54±0,02*	2,11±0,30*	13,45±0,54	3,51±0,03*	0,74±0,09*	72,98±0,97*	1,051±0,014
3		1,500±0,000	1,55±0,03*	1,67±0,04*	12,55±0,24*	3,72±0,09*	0,54±0,14*	74,92±0,55*	1,124±0,008*
4		1,470±0,003	1,59±0,08*	1,94±0,06*	13,85±0,14*	3,50±0,01*	0,37±0,11*	72,99±0,22*	1,073±0,003*
5		1,450±0,002	1,46±0,36*	1,92±0,17*	13,96±0,29*	3,49±0,03*	0,24±0,08*	73,49±0,28*	1,066±0,004*
6		1,420±0,001	1,85±0,02*	2,09±0,01*	13,63±0,20*	3,35±0,02	0,17±0,05*	70,81±0,07*	1,006±0,005*
	Среднее:
	за период хранения	1,460±0,010	1,62±0,06*	1,91±0,07*	13,17±0,38	3,52±0,05*	0,50±0,12*	73,38±0,64*	1,071±0,017
	к контролю, %	97,3	65,3	1173,3	101,1	106,3	22,5	104,9	102,1

Примечание. Для анетола указано содержание в 1,5 мл эфирного масла. * Различия с контролем статистически значимы при р <  0,05.

Содержание эфирного масла в эмульсии в процессе хранения снизилось в среднем всего на 2,7 % по сравнению с таковым в свежеприготовленной эмульсии, что было обусловлено уменьшением объема легколетучих компонентов. Содержание двух из них — а -пинена и анисового альдегида через 1 мес хранения эмульсии уменьшилось соответственно в 1,4 и 2,4 раза. В последующие месяцы процентное содержание а -пинена колебалось в пределах 1,46-1,85 %, а содержание анисового альдегида постепенно снижалось до 0,17 %. Отличия содержания этих компонентов в эфирном масле из эмульсии от таковых в контроле были статистически значимы (р <  0,05). При минимальном процентном содержании лимонена в исходном эфирном масле (0,15 %) оно достоверно (р <  0,05) увеличилось в процессе хранения в среднем до 1,91 % за счет уменьшения общего объема эфирного масла. Количество фенхона на протяжении всего срока хранения существенно не менялось и составляло в среднем 101,1 % к контролю. Незначительные колебания содержания в пределах 3,35-3,72 % были отмечены для метилхави-кола. Процентное содержание основного компонента эфирного масла фенхеля обыкновенного — анетола уже через 1 мес хранения эмульсии за счет уменьшения общего объема эфирного масла достоверно увеличилось на 7,4 % (р <  0,05) и далее колебалось в небольших пределах, составив в среднем за 6 мес 104,9 % по сравнению с контролем.

Анализ полученных результатов позволяет заключить, что небольшое (в пределах 2,7-4,0 %) снижение содержания эфирного масла в эмульсиях было связано с потерей легколетучих компонентов. При этом увеличивалась доля основных компонентов, а их фактическое содержание в 15 мл соответствующей эмульсии с 10 % содержанием эфирного масла оставалось практически постоянным: в среднем 1,029±0,011 мл линалоола и 1,071±0,017 мл анетола при хранении на протяжении полугода при температуре 20-22 ° С. Содержание этих компонентов в контроле составляло 1,02 мл линалоола и 1,05 мл анетола в 1,5 мл эфирного масла кориандра и фенхеля, соответственно.

Результаты микробиологического исследования обеих эмульсий показали отсутствие микрофлоры во всех вариантах опыта, даже при хранении в течение 1 мес в открытом виде. Это соответствует информации об антибактериальных и в целом антимикробных свойствах эфирных масел кориандра посевного и фенхеля обыкновенного (28-31).

Использование фитогенной добавки в виде липосомальной эмульсии, помимо преодоления гидрофобности эфирных масел, удобно еще и для их дозирования. Так, ранее в своих исследованиях мы добавляли в корм телятам смесь эфирных масел кориандра посевного и фенхеля обыкновенного в соотношении 50:50 (32). Для получения такого соотношения смешивать эмульсии с учетом количества содержащихся в них эфирных масел значительно проще, чем смешивать чистые эфирные масла при столь минимальной дозировке. Было установлено, что смеси применяемых эфирных масел активирует факторы неспецифической резистентности и повышают иммунный статус организма молодняка крупного рогатого скота (28 ) .

В настоящей работе мы выбрали гены для исследования таким образом, чтобы охватить ключевые функциональные этапы иммунного ответа животных (4). При повышении экспрессии генов уменьшается необходимое число циклов амплификации. Чем меньше циклов надо провести для фиксации роста логарифмической кривой, тем активнее работает ген и интенсивнее идет синтез кодируемого им белка.

Интерлейкин 6 (IL-6) — провоспалительный цитокин, который относится к сигнальным молекулам, основная функция которых состоит в привлечении дополнительных лейкоцитов из циркулирующей крови к месту инфекции для повышения устойчивости эпителиальных клеток. В контрольной группе экспрессия гена IL-6 была ниже, чем в опытных (рис., А).

Интерлейкин-8 (IL-8) — один из самых мелких по размерам цитокинов (8 кДа), его синтезируют моноциты и макрофаги. Биологическая функция этого провоспалительного цитокина — высокая активность хемоаттрактанта для нейтрофилов, базофилов и Т-лимфоцитов. IL-8 стимулирует секрецию гистамина базофилами и служит одним из активаторов ангиогенеза, что способствует восстановлению проводящей системы организма. В опытных группах телят экспрессия гена IL-8 оказалась выше, чем в контрольной (см. рис., Б).

Относительная экспрессия генов IL-6 (А) , IL-8 (Б) и SIRT3 (В) в лейкоцитах крови телят ( Bos taurus ) черно-пестрой породы молочного периода выращивания при добавлении в заменитель цельного молока смеси эмульсий эфирных масел фенхеля обыкновенного ( Foeniculum vulgare Mill.) и кориандра посевного ( Coriandrum sativum L.) ( n = 3, M ±SEM; Всероссийский НИИ физиологии, биохимии и питания животных, 2023 год). Описание групп см. в разделе «Методика».

* и ** Соответственно p < 0,05 и p < 0,01 по отношению к контролю.

Сиртуин 3 (SIRT3) в основном локализован в клетках тканей с высокой метаболической активностью, его считают регулятором митохондри- ального метаболизма. Он активирует множество белковых мишеней, модулирует ключевые клеточные и физиологические процессы, что отражается на интенсивности обмена веществ и продуктивности. В наших экспериментах экспрессия гена SIRT3 в опытных группа была в 2 и более раз выше по сравнению с контролем (см. рис., В).

Полученные результаты свидетельствует, что смесь эмульсий эфирных масел фенхеля обыкновенного и кориандра посевного в составе кормовой добавки оказывала выраженное иммуностимулирующее действие и способствовали повышению неспецифической резистентности телят в период молочного откорма.

Дефицит SIRT3 вызывает митохондриальную дисфункцию гладкомышечных клеток легочной артерии, что приводит к ремоделированию сосудов и возникновению легочной гипертензии ( 33 ). Повышение экспрессии гена SIRT3 обеспечивает повышение стресс-резистентности и антиоксидантных свойств организма. Повышенная экспрессия SIRT3 приводит к снижению продукции активных форм кислорода (АФК), улучшению утилизации энергии и восстановлению клеточной энергетики. Также повышенная экспрессия SIRT3 поддерживает оптимальное функционирование митохондрий, предупреждает оксидативный стресс и служит одним из основных факторов профилактики ряда хронических заболеваний, что позволяет прогнозировать увеличение продуктивности у телят опытной группы (34).

Учитывая, что в наших исследованиях смесь эфирных масел кориандра посевного и фенхеля обыкновенного поступала в организм телят на протяжении 2,5 мес в минимальном суммарном количестве (1 мл), основными действующими веществами следует считать именно линалоол и анетол. Их суммарное содержание в 10 мл эмульсии (в суточной порции) составляло около 0,7 мл, а доза остальных компонентов была столь незначительна, что едва ли могла оказать какое-либо существенное воздействие.

Эфирные масла кориандра посевного и фенхеля обыкновенного в рамках настоящего исследования рассматриваются как потенциальные антимикробные агенты и иммуностимуляторы, чье действие может проявляться в активации генов ассоциированных с иммунной системой. Ранее в исследованиях P.D. Katsoulos с соавт. (35) было установлено, что включение эфирного масла душицы обыкновенной в рацион телят способствует снижению частоты диареи и уменьшению необходимости в применении антибактериальных препаратов. Согласно данным L.A. Ritt с соавт. (36), масла корицы, орегано и эвкалипта обладают иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами. В работе Т. Liu с соавт. (11) при скармливании телятам фитобиотических добавок на основе эфирных масел, содержащих такие биологически активные соединения, как карвакрол, кариофиллен, п-цимол, цинеол, терпинен и тимол, было зафиксировано повышение в сыворотке крови количества иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA. Подобные эффекты были подтверждены и в исследовании S.B. Al-Suwaiegh с соавт. (37), где наблюдалось достоверное увеличение концентраций общего белка и глобулинов в сыворотке крови, а также положительное влияние на молочную продуктивность коров при введении в рацион смеси масел гвоздики, душицы и можжевельника. Повышение неспецифической резистентности непосредственно влияет на поддержание целостности кишечного барьера и регуляцию провоспалительных реакций, способствуя иммунному гомеостазу, что также было продемонстрировано в нашем исследовании по использованию эмульсии на основе смеси эфирных масел кориандра посевного и фенхеля обыкновенного. Указанные механизмы позволяют предположить, что использование фитобиотиков на основе эфирных масел усиливает неспецифическую защиту кишечника, снижая вероятность возникновения заболеваний, ассоциированных с энтеропатогенной микрофлорой, и способствуя активации иммунных реакций у молодняка.

По результатам исследования мы получили патент на фитогенную липосомальную эмульсию (38). Эмульсия малокомпонентная, содержащая эфирное масло, может использоваться как в качестве фитогенной добавки в корм сельскохозяйственных животных и птицы, так и в пищевом и косметическом производстве.

Имеется ряд патентов на изобретение эмульсий, включающих разные компоненты, в том числе эфирные масла (39-41). Как правило, они предназначены для использования в пищевом и косметическом производствах. Информация об использовании подобных эмульсий в качестве фи-тогенных добавок в животноводстве и птицеводстве отсутствует. Также нет информации о стабильности качественных параметров эмульсий при хранении.

Таким образом, разработанная нами фитогенная липосомальная эмульсия, содержащая 10 % эфирного масла кориандра посевного или фенхеля обыкновенного, может храниться на протяжении, как минимум, 6 мес. Содержание эфирных масел при исходном количестве 1,5 мл в 15 мл каждой из липосомальных эмульсий на протяжении 6 мес уменьшилось в незначительных пределах — 2,7-4,0 %, что было следствием потери легколетучих компонентов. Вследствие уменьшения объема эфирного масла содержание основных компонентов (анетол в эфирном масле фенхеля и линалоол в эфирном масле кориандра) уже через 1 мес увеличилось в процентном отношении и на протяжении всего срока хранения составляло в среднем 104,9 % по сравнению с контролем. Фактическое же их содержание в 15 мл соответствующей эмульсии оставалось практически постоянным: в среднем 1,029±0,011 мл линалоола и 1,071±0,017 мл анетола, что не отличается от такового в 1,5 мл исходного эфирного масла (контроль) — соответственно 1,022±0,002 и 1,049±0,006 мл. Микробиологический анализ эмульсий показал отсутствие в них микрофлоры, в том числе после 1 мес хранения в открытом виде, что соответствует информации об антибактериальных и антимикробных свойствах эфирных масел кориандра посевного и фенхеля обыкновенного. Добавление фитоэмульсии на основе кориандра посевного и фенхеля обыкновенного в заменитель цельного молока при кормлении телят черно-пестрой породы молочного периода выращивания оказывало положительное влияние на активацию не только интерлейкинов, обусловливающих развитие гуморального иммунитета, но и на белки, отвечающие за обмен веществ. Полученные стабильные формы эмульсий на основе кориандра посевного и фенхеля обыкновенного могут применятся в различных областях народного хозяйства (фармацевтической, пищевой, сельскохозяйственной). Период хранения до полугода предусмотрен на перспективу в случае широкого применения кормовой добавки в сельскохозяйственной практике с учетом неодновременного появления молодняка в разных хозяйствах.