Анализ влияния эндогенных и экзогенных факторов на функциональную активность клеток крови у быков

Введение. Эффективное управление реализацией генофонда высокопродуктивных сельскохозяйственных животных возможно лишь на основании научно обоснованных данных, полученных с помощью разноуровневых индикаторов. Проявление высокой продуктивности сельскохозяйственных животных обеспечивается интенсивным функционированием всех органов и систем организма, стабильность и устойчивость работы которых зависит от множества факторов эндогенной и экзогенной природы. Отклонение последних от оптимальных пределов приводит к сбою гомеостатического режима работы данного организма с потерей не только продуктивности и здоровья, но и даже его жизнеспособности [1, 2]. В связи с этим выявление первичных критических моментов изменения состояния организма является актуальной задачей, решение которой позволяет на ранних стадиях классифицировать неблагоприятное влияние и принять меры к устранению воздействия. Одной из главнейших связующих систем целостного организма является периферическая кровь. Она не только обеспечивает нормальное функционирование организма, но и является активно действующей составной частью системы неспецифической резистентности и специфического иммунитета. Исследование цитоморфологического состава и биохимических характеристик периферической крови имеет большое диагностическое значение [1, 2]. Особую роль в обеспечении неспецифической резистентности, как первичной защитной реакции на экзогенные и эндогенные раздражители, играют клетки крови, способные к фагоцитозу [3]. Проявление функциональной активности фагоцитов на всех этапах фагоцитарного процесса сопровождается продукцией активных форм кислорода (АФК), слабо выраженной в состоянии нормы и протекающей в виде респираторного взрыва в состоянии антигенной активации [3]. В зависимости от объема генерируемые АФК способны повреждать не только чужеродные агенты, но и собственные молекулярные структуры. В норме регуляция продукции АФК и свободных радикалов в тканях и органах осуществляется многоуровневой физиологической антиоксидантной системой, которая включает в себя соединения различной химической природы: витамины, пигменты, гормоны, ферменты [4]. Важной составляющей, описывающей состояние гомеостаза, является оптимальный баланс окислительно-восстановительных реакций: равновесие между процессами образования АФК и реакциями антиоксидантной системы. Разные комбинации экзо- и эндогенных факторов могут привести к сдвигу равновесия оксиданты – антиоксиданты, что неблагоприятно воздействует на организм.

В связи с этим, осуществляя мониторинг функциональной активности иммунокомпетентных клеток крови (ИКК), выполняемый на молекулярном уровне по кинетике генерации АФК клетками периферической крови с помощью хемилюминесцентного (ХЛ) метода, можно выявить тонкие изменения в механизмах функционирования системы иммуногенеза, не всегда проявляющиеся на субклеточном и клеточном уровнях, но вместе с тем играющие ключевую роль в формировании патогенетических механизмов. Интенсивность хемилюминесценции коррелирует с потреблением клетками кислорода и степенью завершенности фагоцитоза, поэтому имеет смысл оценить интегральную составляющую, отражающую резервные возможности антиоксидантного потенциала. ХЛ-кривая кинетики генерации АФК ИКК является одним из интегральных показателей состояния системы иммуногенеза, и ее регистрация может служить одним из экспресс-методов ранней диагностики иммунодефицитных состояний [5–8].

Цель исследований. Изучить зависимость функциональной активности антигенактивиро-ванных in vitro клеток крови быков от эндогенных и экзогенных факторов.

Задачи: выявление значимых факторов, влияющих на генерацию АФК клетками крови; установление параметров влияния этих факторов.

Материалы и методы исследований. В качестве объекта использована периферическая кровь клинически здоровых быков–спермодоно-ров ОАО «Красноярскгосплем», отбираемая в период ежегодных плановых весенне-осенних и внеплановых зимних ветеринарных обследований 1999–2014 гг. Функциональную активность клеток крови при антигенной стимуляции in vitro оценивали по кинетике генерации АФК, регистрируемой микрометодом люминолусиленной хемилюминесценции с использованием аппаратурно-программного комплекса «Хемилюминометр CL-3604» – ПЭВМ (СКТБ «Наука» СО РАН) [9, 10]. Время записи хемилюминесцентной кривой составляло 180 минут при температуре в регистрационной камере 37 ^ºС. Реакционная смесь регистрационной кюветы состояла из 200 мкл 2,2·10^-4 М люминола (Sigma) в растворе Хенкса (рН – 7,2), 100 мкл гепаринизированной крови животных в разведении 1:1 в растворе Хенкса, 50 мкл суспензии монодисперсных частиц латекса (ВНИИСК, С-Петербург) в растворе Хенкса концентрацией 5·10⁸ част/мл, опсонизированных белками пуловой сыворотки крови крупного рогатого скота.

О кинетике генерации АФК в системе клеток цельной крови быков судили по параметрам хемилюминесцентной кривой, принимая во внимание наиболее информативные: амплитуду максимальной активности хемилюминесцентной реакции (Imax – имп/с), время достижения максимума (Tmax – мин) и площадь под кривой хемилюминесценции (S – имп. за 180 мин), определяющей общее количество АФК, генерируемых клетками за время записи хемилюминесцентной кривой. Анализ хемилюминесцентной кинетики генерации АФК и оценку функционального состояния клеток крови выполняли по методу M.Y. Magrisso et al. [9]. Статистическую обработку данных и дисперсионный двухфакторный анализ осуществляли по алгоритмам пакета «анализ данных» программы Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение. При используемом разведении образцов крови регистрируемая хемилюминесцентная кинетика генерации АФК клетками при антигенной активации in vitro характеризовалась двумя максимумами (рис.1) [10]. Формирование первого из них отражает активацию фагоцитарного процесса (адгезия, поглощение частиц латекса). Второй пик генерации АФК обусловлен эндогенной активацией «резервных» нейтрофилов [11], а также образованием липидных и белковых пероксидов [5, 6].

Многолетние исследования функциональной активности клеток крови здоровых быков-спермодоноров ОАО «Красноярскгосплем» выявили возрастную и сезонную динамику способности клеток крови генерировать АФК в ответ на антигенную стимуляцию in vitro [11, 12], которая проявляется прежде всего в изменении соотно- шения амплитуды первого и второго максимума интенсивности хемилюминесценции (рис. 1). Амплитуда первого максимума (Imax1) с возрастом изменяется незначительно, но проявляется тенденция снижения, начиная с двухлетнего возраста, наиболее заметно проявляющаяся в весенний период (рис. 2). Наименьшие значения (726±73 имп/с) выявлены у быков в возрасте старше 4–5 лет в весенний период, в то время как размах величин второго максимума (Imax2) составлял от 1447± 87 имп/с в группе 37– 48 мес. до 3887±525 имп/с в группе старше 61– 72 мес. в весенний период и от 1133±115 (возраст 19–24 мес.) до 3227±931 (возраст 61– 72 мес.) при общей тенденции снижения величины первого и повышения второго максимума в возрасте старше 36 мес.

Время достижения первого и второго максимума также является важной характеристикой продукции АФК (табл. 1).

Таблица 1

Значение параметров времени достижения первого (TmaxI) и второго (TmaxII) максимумов ХЛ кинетики генерации клетками крови быков разновозрастных групп в разные сезонные периоды

Возраст, месяц

Tmax(I), мин

Tmax(II), мин

Осень

n

Зима

n

Весна

n

Осень

n

Зима

n

Весна

n

До 18

18±2

64

15±1

20

19±4

35

133±2

64

130±3

20

123±6*

35

19–24

18±1

76

–

–

19±2

36

123±3

76

–

–

122±3

36

25–36

17±1

126

14±1

9

21±2

93

121±2

126

118±6

9

122±3

93

37–48

18±2

49

18±1

8

22±2

68

124±3

49

120±6

8

133±3*

68

49–60

19±2

64

13±8

12

20±3

43

123±3

64

116±7

12

131±6*

43

61–72

17±8

17

8±35

2

13±5

30

124±7

17

169±23

2

125±9

30

Старше 73

16±6

12

11±2

2

19±5

13

131±8

12

165±3

2

132±8

13

* Достоверные отличия от значений осенью (P < 0,05).

Следует отметить, что оно имеет четкие периоды проявления, связанные, вероятнее всего, с видовой особенностью. Первый максимум достигается на 18±1 минуте осенью, 17±1 минуте зимой, на 19±1 – весной. Второй максимум на 127±2 мин весной, 127±3 – зимой и 126±2 – осенью. Однако есть достоверные отличия этих параметров для одновозрастных групп в различные сезонные периоды (см. табл. 1).

Регистрируемая хемилюминесцентная кинетика генерации АФК клетками крови при антигенной активации in vitro представляет собой интегральную характеристику продукции АФК во вне- и внутриклеточную среду при участии клеточных про- и антиоксидантных ферментативных структур, активирующихся в процессе фагоцитоза, и про- и антиоксидантных факторов, функционирование которых напрямую не связано с фагоцитозом (супероксиддисмутаза (СОД) эритроцитов, металлы с переменной валентностью, витамины и др.). Согласно методу анализа ХЛ кинетики по M.Y. Magrisso et al. [9], каждая хемилюминесцентная кинетическая кривая может быть представлена как сумма трех стати- стических распределений-компонент (рис. 2). Первая компонента представляет процессы, связанные с фагоцитозом и происходящие около плазматической мембраны, отражает кинетику внеклеточной генерации АФК при распознавании и адгезии. Вторая компонента характери- зует процессы внутри клетки, связанные с фагоцитозом, и представляет внутриклеточную генерацию АФК. Третья компонента описывает кинетику генерации внутриклеточных АФК, напрямую не связанной с фагоцитозом [9].

Рис. 1. Возрастная динамика амплитуды максимумов (I max1 и I max2 ), кинетики продукции АФК антигенактивированными in vitro клетками быков-производителей в весенний и осенний периоды (1999–2014 гг.).

зима все зима ком I зима ком II

в

S s

0       20       40       60       80      100      120      140      160      180

Продолжительность регистрации, мин.

Рис. 2. Компонентная структура люминолусиленной хемилюминесцентной кинетики генерации АФК клетками крови быков-спермодоноров разного возраста в зимний период

Компонентный анализ кинетики генерации АФК клетками крови разновозрастных групп быков, по M.Y. Magrisso et al. [9], показал, что изменение с возрастом интегрального объема S генерации люминолзависимых АФК с общей тенденцией увеличения к 6–7 годам определяется изменением третьей компоненты, характеризующей фагоцитознезависимую генерацию АФК (см. рис. 2). В старшем возрасте (73 мес. и старше) отмечено снижение показателя на 21,8 % от максимального значения в предыдущий период.

При этом изменение ХЛ показателей соотносится с изменением гомеостаза и продуктивности спермодоноров. Так, Е.В. Четвертакова (2016) указывает, что «…быки в возрасте до двух лет характеризуются нестабильными половыми функциями, в результате чего от них было получено минимальное количество семени» [13]. По результатам компонентного анализа этот период (до 18 месяцев) характеризуется самой высокой величиной S первой и второй компоненты (табл. 2) при сравнительно низких показателях S третьей компоненты, что определяется высокой активностью про- (НАДФН-оксидазы, миелопероксидазы) и антиоксидантных ферментов (СОД, каталазы), участвующих в формировании респираторного взрыва при фагоцитозе [3, 5]. И в то же время достаточно высока активность антиоксидантных ферментов глутатионового ряда (глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы, глутатионредуктазы), роль которых весьма значима в окончательной дисмутации образующихся свободных кислородных, липидных и белковых радикалов [6].

То есть период до 1,5 лет, наряду с пониженными биотехнологическими показателями спермопродукции, характеризуется сравнительно высокой активностью внутриклеточных и про-и антиоксидантных систем.

Исследованиями возрастного изменения баланса активности про- и антиоксиданых ферментов в нейтрофилах [14] выявлена наиболее высокая активность про- и антиоксидантных ферментов в молодом возрасте организма с закономерным снижением активности всех ти-

Вестник КрасГАУ. 2021. № 8 пов антиоксидантных ферментов, причем более интенсивным для каталазы, и увеличением пе-рикисного окисления липидов и белковых молекул. Очевидно, следствие этого процесса регистрируется в наших исследованиях возрастного изменения хемилюминесцентной кинетики генерации АФК: снижение активности нарастания респираторного взрыва при активации фагоцитоза и его медленное гашение.

Значение максимальной интенсивности фаго-цитозсвязанной продукции АФК у особей не старше 4 лет в осенний период несколько выше, чем величина второго максимума, в весенний же период средние величины первого максимума достоверно (P < 0,05) меньше средних величин второго максимума, к тому же в периферической крови крупного рогатого скота количественно доминирует фракция лимфоцитарных клеток (60– 70 % лейкоцитов), не участвующих в фагоцитозе. Рассматривая покомпонентно характеристику времени достижения максимума, выявили устойчивые периоды достижения максимума вне зависимости от сезона по 1-й и 2-й компоненте, 8-я и 23–25-я минута соответственно. Третья компонента достигает своего максимума быстрее зимой (117±2 мин), а осенью и весной позднее соответственно на 126±1 и 130±2 мин.

Используя значения показателей модельных составляющих, выполнили оценку функционального состояния фагоцитирующих клеток крови КРС разного возраста. У быков разного возраста функциональное состояние клеток крови, генерирующих АФК при инициации фагоцитоза, по методу Magrisso et. al. [10] характеризуется в основном как «альтернативно активированное» в осенний и зимний периоды и «отдыха» в весенний (см. табл. 2).

Таким образом, объем АФК, связанных с фагоцитозом, у клинически здоровых быков-спер-модоноров зависит от сезона. При этом доля общей продукции АФК, связанной с фагоцитозом, составляет не более 41 % в зимний период. Минимальная доля фагоцитозсвязанной продукции АФК регистрировалась в весенний период – 12 %, что достоверно (P < 0,05) меньше, чем в осенний и зимний период.

Таблица 2

Сезонно-возрастные особенности функционального состояния лейкоцитарных клеток крови быков-спермодоноров при активации фагоцитоза in vitro

Возраст, месяц	Весна		Осень		Зима
	Тип активности клеток крови	Доля (%) фагоцитоз-связанной продукции АФК	Тип активности клеток крови	Доля (%) фагоцитоз-связанной продукции АФК	Тип активности клеток крови	Доля (%) фагоцитоз-связанной продукции АФК
Все	1	16,9	2	29,8	2	32,4
До 18	1	21,2	1	36,0	2	41,1
19–24	1	22,8	2	33,6	-	-
25–36	1	18,8	2	31,6	1	28,5
37–48	1	20,7	2	31,6	2	20,5
49–60	1	12,7	2	26,3	2	31,0
61–72	1	12,3	2	12,8	1	19,6
Старше 73	1	12,3	2	16,0	1	21,0

Примечание : 1 – состояние «отдыха» при слабой презентации антигена, нет готовности к активному бактерицидному действию; 2 – состояние «альтернативной активации», клетки активно генерируют АФК при фагоцитозе, но большее количество АФК генерируется вне фагоцитоза.

Для анализа значимости влияния из группы вания АФК клетками крови, выбраны два незави-факторов, воздействующих на процессы образо-  симых – «возраст животного» и «сезон» (табл. 3).

Таблица 3

Дисперсионный анализ влияния факторов «сезон» и «возраст животного» на интегральный объем генерации АФК клетками крови быков-спермодоноров (S, имп. за 180 мин)

Источник вариации	SS	df	MS	F	P-значение	F критич .
Сезон	1,416·1015	3	4,722·1014	2,777	0,04480	2,689
Возраст	5,885·1015	2	2,943·1015	17,305	0,00000003	3,080
Взаимодействие факторов	4,134·1015	6	6,890·1014	4,052	0,00106	2,184
Внутри	1,836·1016	108	1,700·1014	–	–	–
Итого	2,980·1016	119	–	–	–	–

Примечание . Источники вариации: «внутри» – случайная; «итого» – общая.

Взаимодействие факторов в данном случае означает, что интегральный объем генерации АФК в различные сезоны зависит от возраста животного.

Поскольку по фактору «сезон» критерий Фишера F = 2,77 > Fкритич = 2,689, а р-значение равно 0,0448 и меньше уровня значимости, гипотеза Н0 отклоняется. Следовательно, можно утверждать, что между интегральным объемом генерации АФК в разные сезоны существует разница. По фактору «возраст» F = 17,305 > F кри-тич. = 3,080, а р-значение равно 0,3·10-7 и меньше уровня значимости, гипотеза Н0 отклоняется. Следовательно, значение площади свечения S, характеризующего объем генерации АФК за время регистрации, статистически значимо (p < 0,001) зависит от возраста животного.

Выводы. Функциональная активность клеток крови быков-производителей, оцениваемая по способности генерировать АФК при антигенной активации in vitro , имеет двухфазную кинетику и характеризуется закономерной возрастной динамикой и сезонной зависимостью. Кинетика генерации АФК характеризуется стабильными параметрами времени достижения максимумов и изменяющимися в зависимости от возраста и сезона максимальной интенсивностью первого (I max1 ) и второго (I max2 ) максимумов и общего объема (S) генерируемых АФК.

Увеличение интегрального объема продукции всех видов АФК люминолзависимых АФК определяется ростом максимальной интенсивности и объема третьей компоненты генерации свободных радикалов кислорода – внутриклеточной и внеклеточной, несвязанных с процессом фагоцитоза. У быков разного возраста состояние образования АФК в крови в основном «альтернативное активизированное» и только в возрасте 47–50 месяцев – «отдых».

Эффект влияния взаимодействия факторов «сезон» и «возраст животного» на объем генерируемых АФК клетками крови быков статистически значим (p < 0,01) при показателе силы влияния для взаимодействия 13,87 %. При этом сила влияния фактора «возраст животного» составляет 19,75 %, а влияние фактора «сезон» на объем АФК – 4,75 %.