Анализ возможности подбора доноров тромбоцитов для пациентов с рефрактерностью

трансплантации костного мозга предусматривают обязательное использование переливаний концентрата тромбоцитов для коррекции длительной ги-попролиферативной тромбоцитопении, что значительно снижает частоту серьезных геморрагических осложнений [3]. Из-за продолжительности периода недостаточности кроветворения таким пациентам необходимы серийные, множественные трансфузии

[4]. Однако при многократных трансфузиях концентрата тромбоцитов у некоторых пациентов после трансфузии может наблюдаться отсутствие прироста количества циркулирующих тромбоцитов в крови, что ведет к снижению гемостатического эффекта, развитию посттрансфузионных реакций и т. д. Это может оказать неблагоприятное влияние на результат комплексной терапии, так как высок риск развития тяжелого геморрагического синдрома [3, 5].

Состояние, при котором регистрируется отсутствие адекватного прироста уровня тромбоцитов после 2-х или более трансфузий тромбоконцентра-та, называется рефрактерностью. Различают иммунную и неиммунную рефрактерность. Причиной неиммунной рефрактерности может быть спленомегалия, высокая лихорадка, сепсис, ДВС-синдром, кровотечение, веноокклюзивная болезнь печени, РТПХ, применение некоторых фармпрепаратов и т. д. Иммунная рефрактерность развивается вследствие аллоиммунизации. Считается, что главной причиной иммунной рефрактерности у пациентов с множественными трансфузиями тромбоцитов является сенсибилизация антигенами присутствующих в тромбоконцентрате лейкоцитов системы HLA (Human Leukocyte Antigens) донора, отсутствующими у реципиента, и появление иммунных HLA-А и/ или HLA-В-антител. В результате снижается посттрансфузионный прирост числа тромбоцитов и их выживаемость, уменьшается эффективность трансфузий, вплоть до полного отсутствия гемостатического эффекта, что ведет к возникновению угрозы для жизни пациента [6, 7]. Однако, кроме лейкоцитарных антигенов HLA (класса I), эритроцитарных антигенов систем АВO, Левис, I, i, P, на тромбоцитах присутствуют и собственные тромбоцит-специфич-ные антигены HPA (Human Platelet Antigens). На сегодняшний день 35 HPA были идентифицированы и официально утверждены Международным комитетом по номенклатуре иммунологии тромбоцитов Международного общества переливания крови ISBT [8]. Все HPA расположены на гликопротеиновых комплексах GPIIb/IIIa, GPIb/V/IX, GPIa/IIa и CD109 на мембране тромбоцитов [9, 10].

В настоящее время при подборе донорских тромбоцитов антигенный состав тромбоцитов донора и реципиента не учитывается. При многократных трансфузиях выработка аллоантител возможна сразу к нескольким антигенам донора, при этом в процессе гемокомпонентной терапии образование аллоантител происходит не у всех пациентов и зависит от HLA- и HPA- генотипа пациента, иммуногенности антигенов, присутствующих на тромбоцитах донора, наличия в концентрате тромбоцитов мононуклеарных клеток [11, 12]. Также, кроме множественных трансфузий компонентов донорской крови, причиной выработки антитромбоцитарных аллоантител у пациентов могут быть предыдущие беременности (женщина иммунизируется тромбоцитарным антигеном плода, не представленным на ее собственных тромбоцитах), наличие аутоиммунного процесса, онкологические и инфекционные заболевания, генетические факторы [13-15].

Антитела против специфических антигенов тромбоцитов, вызывающие в дальнейшем трансфузионную рефрактерность, встречаются у 20-25% пациентов даже при трансфузиях тромбоцитов, совместимых по антигенам системы HLA [15, 16]. Наиболее клинически значимыми являются анти-HPA-1a, анти-HPA-5b, анти-HPA-3а и анти-HPA-3b антитела. Известно, что частота встречаемости разных аллельных вариантов НРА антигенов в России не отличается от других европейских популяций и отклоняется в сторону «а» аллеля, а гомозиготы по «b» составляют от 0 до 15% [17]. Поэтому вероятность совместимости пациента и донора, выбранного без учета антигенного состава тромбоцитов, невелика. Если в рефрактерности задействованы иммунные механизмы, одним из путей преодоления проблемы и достижения лечебного эффекта является возможность подбора пары донор/реципиент, совместимых по антигенному составу тромбоцитов. Предпочтительным является донор, имеющий наименьшее количество различий с реципиентом по локусам генов HPA.

Цель . Изучить встречаемость редких аллелей генов НРА у доноров ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России. Оценить возможность подбора пары донор/реципи-ент, совместимых по тромбоцитарным антигенам.

Материалы и методы. Обследован 471 донор крови ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России. В составе группы 139 женщин и 332 мужчины. Медиана возраста составила 43 года. Обследованы 4 пациента (3 женщины и 1 мужчина) с подозрением на рефрактер-ность к трансфузиям тромбоконцентрата. Доноры и пациенты типированы по аллелям локусов HPA1, HPA2, HPA3, HPA4, HPA5, HPA6, HPA9, HPA15 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени на анализаторе FluoVista (Inno-Train, Германия), используя набор реактивов HPA-FluoGene (Inno-Train, Германия). Геномную ДНК выделяли с помощью комплекта реагентов «ДНК-сорб-В» (AmpliSens, Россия) из цельной крови, взятой в пробирку с 5% К2ЭДТА. Генотипы пациентов сравнивали с генотипами 471 донора из базы доноров крови, типированных по аллелям локусов HPA, созданной в ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России за 2018-2023 г.г. Частота аллелей HPA была подсчитана методом прямого подсчета.

Результаты и обсуждение . Распределение аллелей генов HPA, обнаруженных у обследованных доноров, показано в таблице 1.

Таблица 1

Частота встречаемости аллелей генов HPA у доноров крови ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России

Локусы HPA	Частота генотипов, %			Встречаемость аллеля b, %
	aa	ab	bb
HPA1	68,4	28,7	2,9	31,6
HPA2	84,9	14,9	0,2	15,1
HPA3	30,1	50,7	19,2	69,9
HPA4	100,0	0	0	0
HPA5	82,6	15,5	1,9	17,4
HPA6	98,9	1,1	0	1,1
HPA9	99,6	0,4	0	0,4
HPA15	28,0	52,9	19,1	71,9

По аллелю «а» локуса HPA-4 все обследованные доноры были гомозиготны, аллель «b» не встречался. В локусах HPA-6 и HPA-9 аллель «b» встречался реже всего и обнаружен только у 1,1% и 0,4% соответственно. Полученные данные согласуются с результатами российских и зарубежных авторов, из- учающих частоту встречаемости аллелей генов HPA среди белых европейцев.

Распределение аллелей генов HPA, обнаруженных у обследованных пациентов с подозрением на рефрактерность, показано в таблице 2.

Таблица 2

Распределение аллелей генов HPA у обследованных пациентов

Обследуемые	Обнаруженные аллели генов HPA
	HPA1	HPA2	HPA3	HPA4	HPA5	HPA6	HPA9	HPA15
Пациентка Б.	аb	аа	bb	аа	аb	аа	аа	аb
Пациентка С.	аb	аа	аа	аа	аа	аа	аа	bb
Пациент Б.	аa	аа	aa	аа	аа	аа	аа	aa
Пациентка Л.	аb	аа	bb	аа	аа	аа	аа	ab

В результате сравнительного анализа генотипов доноров базы и генотипов обследованных пациентов с учетом групповой принадлежности по АВО и Rh были выбраны доноры, совместимые с реципиентами по антигенному составу тромбоцитов.

На рисунке 1 в процентном соотношении показано количество подходящих по генотипу доноров из базы ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.

Как видно из рисунка 1, % совместимых доноров весьма невысок. Количество идентичных по исследуемым антигенам доноров составило 0,21 – 0,64 %, совместимых – от 0,42 до 1,9 %.

Клинический случай

Пациентка Б. (диагноз: идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура), 68 лет, группа крови A(II) Rh+, фенотип ссееК-, рефрактерная к трансфузиям тромбоконцентрата. У пациентки были обнаружены аллели HPA-1а/b, HPA-2а/а, HPA-3b/b, HPA-4 а/а,

HPA-5а/b, HPA-6а/а, HPA-9а/а, HPA-15а/в. Пациентка гомозиготна по аллелю «b» локуса HPA-3, что значительно сокращает возможность подбора, так как встречаемость генотипа HPA-3b/b у белой расы составляет около 19% [18, 19]. В имеющейся базе доноров встречаемость такого генотипа – 19,2%. В результате сравнения обнаруженных у пациентки локусов генов HPA с данными доноров базы с учетом АВО и резусной принадлежности совместимость по антигенному составу тромбоцитов в паре донор/ре-ципиент обнаружена в 8 случаях (1,7%), а полное совпадение определяемых локусов обнаружено только у 1 донора (0,2%). Результаты генотипирования пациентки и совместимых доноров представлены в таблице 3.

Паиисшы

Рисунок 1. Количество доноров (%), идентичных (светло-серый цвет, вторые столбики) и совместимых (темно-серый цвет, первые столбики) с реципиентами по исследованным антигенам HPA.

Таблица 3

Генотипы пациентки и доноров тромбоцитов , совместимых по обнаруженным аллелям локусов HPA1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 15.

Обследуемые	Обнаруженные аллели генов HPA
	HPA 1	HPA 2	HPA 3	HPA 4	HPA 5	HPA 6	HPA 9	HPA 15
Пациентка	ab	аа	bb	аа	ab	аа	аа	ab
Донор 1 (идентичный)	ab	аа	bb	аа	аb	аа	аа	ab
Донор 2	ab	аа	bb	аа	аа	аа	аа	ab
Донор 3	аа	аа	bb	аа	аа	аа	аа	аа
Донор 4	аа	аа	bb	аа	bb	аа	аа	ab
Донор 5	аа	аа	bb	аа	аа	аа	аа	ab
Донор 6	аа	аа	bb	аа	аа	аа	аа	bb
Донор 7	ab	аа	bb	аа	аа	аа	аа	аа
Донор 8	аа	аа	bb	аа	аа	аа	аа	ab
Донор 9	ab	аа	bb	аа	ab	аа	аа	ab

В данном случае удалось подобрать самое большое количество подходящих для пациентки доноров тромбоцитов – 9 (1,9%). Для остальных 3-х пациентов подходящих доноров оказалось меньше: 2, 3 и 4 соответственно.

В настоящее время в отделениях переливания крови (ОПК) медицинских учреждений тромбоциты заготавливаются строго по заявке, так как срок их хранения составляет не более 5 суток. Для приготовления терапевтической дозы концентрата тромбоцитов (для взрослого реципиента) методом цитафереза требуется 1 человек (донор), из дозы крови – 4. В вышеприведенном примере для получения у пациентки клинического эффекта от транс- фузионной терапии необходимо организовать до-нацию хотя бы от одного из 9 доноров. Вероятность этого может быть стремительно снижена в первую очередь несовместимостью пары донор/реципиент по антигенам системы HLA, а также объективными обстоятельствами: недоступностью донора в связи с местонахождением в данный момент, заболеванием или беременностью (если донор – женщина), необходимостью соблюсти интервал между дона-циями, временным или постоянным отводом от донорства по медицинским показаниям и т.д. Решением проблемы может быть внедрение типирования доноров тромбоцитов в ОПК лечебных учреждений и на станциях переливания крови и внесение ре- зультатов в имеющиеся донорские базы, регистры и т.д. К сожалению, возможности ограничиваются немалой стоимостью реактивов и оборудования для молекулярно-генетических исследований, однако значимость таких мероприятий для охраны здоровья населения не вызывает сомнений и заслуживает внимания.

Выводы

• 1.    Проанализирована встречаемость редких аллелей генов НРА у доноров ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.

• 2.    Проанализирована возможность подбора пары донор/реципиент с учетом антигенного состава тромбоцитов, используя имеющуюся базу доноров. Для 4 пациентов с гематологическими заболеваниями совместимыми оказались всего от 0,42 до 1,9 % доноров. Учитывая естественную убыль доноров базы (переехал, заболел и т.д.), подходящих доноров тромбоцитов может оказаться еще меньше.

• 3.    Необходима дальнейшая работа по расширению базы типированных доноров, что позволит подбирать донорские тромбоциты для реципиентов с рефрактерностью.