Антагонистическая активность штаммов бактерий Bacillus subtilis, выделенных из микробиоты диких копытных животных Якутии

Acknowledgments : the author expresses his sincere gratitude to his scientific supervisor N.P. Tarabukina and scientific mentor M.P. Neustroev for valuable advice, constructive criticism and professional guidance during the research. Special thanks to colleagues for their assistance and cooperation.

Введение. В современном животноводстве одной из значимых проблем являются заболевания, связанные с нарушением микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) у молодняка и взрослого скота, вызванные условно-патогенными и патогенными бактериями. Для профилактики и лечения в рацион добавляют пробиотические добавки и пробиотики, содержащие полезные микроорганизмы, которые нормализуют микрофлору ЖКТ животных. Кормовые пробиотики также служат заменой антибиотикам-промоторам роста, запрет на которые начал дей- ствовать по всей территории Евразийского экономического союза (ЕАЭС) и зафиксирован в Регламенте (EC) № 1831/2003 с 2006 г. В России использование антибиотиков для стимуляции роста животных также запрещено. Это установлено Федеральным законом от 30.12.2021 № 463-ФЗ «О внесении изменений в Закон Российской Федерации «О ветеринарии» и Федеральным законом «Об обращении лекарственных средств».

Антибиотические препараты в течение многих лет использовались у животных для профи- лактики и лечения болезней и играли жизненно важную роль в качестве стимуляторов роста в животноводстве. Тем не менее чрезмерное и неправильное использование противомикроб-ных препаратов в кормах для скота привело к устойчивости организма к лекарственным препаратам, что стало угрожать здоровью как животных, так и человека. Во всем мире появились множественные лекарственно-устойчивые патогены. Устойчивые бактерии у животных могут прямо или косвенно попадать к человеку через пищу, воду, грязь и навоз, которые используют в качестве удобрений. На самом деле, существуют неопровержимые доказательства того, что продукты питания из многих животных источников и на всех этапах их обработки содержат большое количество устойчивых бактерий. Гомологичные взаимосвязи между лекарственноустойчивыми бактериями у человека и животных были выявлены у наиболее распространенных пищевых патогенов, таких как кишечная палочка и сальмонелла, различные типы энтерококков и метициллин-резистентных золотистых стафилококков [1-3].

Во всем мире, в том числе России, стали активно разрабатывать и внедрять кормовые добавки на основе пробиотиков, как альтернативу антибиотиков. Пробиотические кормовые добавки состоят из живых непатогенных микроорганизмов или продуктов их ферментации. К пробиотическим микроорганизмам относят:

• -    бактерии, продуцирующие молочную и пропионовую кислоты ( Lactobacillus , Bifidobacterium , Propionibacterium , Enterococcus );

• -    непатогенные бактерии рода Escherichia ( E. coli М-17);

• -    дрожжи ( Saccharomyces , Candida );

• -    термофильные стрептококки ( Streptococcus );

• -    спорообразующие бактерии ( Bacillus , Clostridium ).

Пробиотические добавки разнообразны по своему составу, но условно их классифицируют:

• -    на монокомпонентные препараты, содержащие один штамм бактерий;

• -    самоэлиминирующиеся антагонисты, к которым относятся представители рода Bacillus, главным образом В. subtilis , B. Licheniformis ;

• -    комбинированные препараты, состоящие из нескольких штаммов бактерий (поликомпо-

• нентные) или включающие добавки, усиливающие их действие;

• -    иммобилизованные на сорбенте (сорбированные) живые бактерии [4].

Для того чтобы быть включенными в группу пробиотиков, микроорганизмы должны соответствовать следующим критериям: предлагаемые для производства штаммы должны быть выделены от природных субстратов; идентифицированы до вида по фено- и генотипическим признакам; иметь генетический паспорт; штаммы должны обладать широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; не должны угнетать нормальный микробиоценоз; оказывать положительный эффект на организм хозяина, например увеличивать противоинфекцион-ную резистентность; иметь в своем составе жизнеспособные клетки или продукты их метаболизма; обладать способностью к выживанию и жизнедеятельности в условиях кишечного микроокружения, например микроорганизм должен быть резистентен к низким значениям рН и органическим кислотам, к высокому содержанию желчи, солей натрия; должны быстро размножаться и/или адгезироваться на эпителиальных клетках кишечника с последующей колонизацией; должны быть непатогенными и нетоксичными, безопасными для людей, включая иммунологическую безопасность; производственные штаммы должны быть стабильны по биологической активности, сохранять жизнеспособные бактерии в течение длительного срока хранения и удовлетворять технологическим требованиям [5].

В последние годы все большее внимание уделяется использованию спорообразующих бактерий, особенно из рода Bacillus , в качестве пробиотических культур. Эти грамположитель-ные, аэробные и спорообразующие микроорганизмы находят широкое применение в сельском хозяйстве, включая производство пробиотиков и ферментов. Одним из наиболее продуктивных видов-антагонистов среди бацилл является Bacillus subtilis , который синтезирует более 65 антимикробных соединений. Его антагонистическая активность охватывает грамположитель-ные и грамотрицательные бактерии, а также вирусы и грибы [6].

Bacillus subtilis не является патогенным для человека микроорганизмом, не содержит эндо- токсинов и считается подходящим для квалифицированного статуса презумпции безопасности (QPS) Европейского органа по безопасности пищевых продуктов. Bacillus subtilis классифицируется как «общепризнанно безопасная бактерия» (GRAS), что позволяет использовать его в качестве безопасного пищевого продукта [7, 8].

Российскими учеными разработано более двадцати пяти пробиотических добавок на основе B. subtilis для кормления сельскохозяйственных животных. К ним относятся: «Ветом», «Ветоспорин-Ж», «Карбитокс», «Субтиспорин», «Энзимспорин», «Ветастар» и другие [9]. Их применение значительно улучшает здоровье и продуктивность сельскохозяйственных животных, что является ключевым фактором для устойчивого развития животноводства. Одним из важнейших аспектов применения Bacillus subtilis является улучшение пищеварения за счет оптимизации процессов ферментации и усвоения питательных веществ в организме животных.

Кроме того, использование добавок с Bacillus subtilis способствует укреплению иммунной системы, что особенно важно для молодняка, еще не обладающего полноценным иммунитетом. За счет стимулирующего воздействия на иммунные клетки, такие как макрофаги и лимфоциты, эти бактерии помогают животным более эффективно противостоять различным инфекциям и стрессовым ситуациям [10, 11]. В конечном итоге это приводит к снижению заболеваемости и смертности среди животных, а также к уменьшению необходимости использования лекарственных препаратов, что в свою очередь снижает риск возникновения резистентных штаммов патогенов.

Не менее важным аспектом является влияние пробиотических добавок на общее состояние и продуктивность животных. Регулярное применение кормовых добавок на основе Bacillus subtilis способствует улучшению аппетита, скорейшему набору массы и повышению удоя у коров. Кроме того, улучшаются качественные характеристики продукции, такие как содержание белка и жира в молоке, а также органолептические свойства мяса. Это делает пробиотики неотъемлемой частью современных технологий в области кормления и содержания скота [12–15].

Кормовые пробиотики на основе Bacillus subtilis , например такие как «Сахабактисубтил», разработанный Якутским НИИСХ, представляют собой эффективное и безопасное средство для повышения здоровья и продуктивности сельскохозяйственных животных. Это позволяет не только решать актуальные проблемы, связанные с заболеваниями ЖКТ и коррекцией микробиоценоза, но и способствует развитию устойчивого и экологически чистого животноводства [16,17].

Поиск, селекция и отбор штаммов бактерий B. subtilis , выделенных из микробиоты диких копытных животных, представляет научный и практический интерес для разработки пробиотических кормовых добавок.

Цель исследования – изучение антагонистической активности шести коллекционных штаммов бактерий B. subtilis в отношении S. aureus , E. coli и S. enteritidis с целью отбора перспективных штаммов в качестве основы пробиотической кормовой добавки.

Задачи: изучить антагонистическую активность шести коллекционных штаммов бактерий B. subtilis в отношении условно-патогенных микроорганизмов; оценить влияние новой среды на антагонистическую активность штаммов бактерий B. subtilis в отношении двух изолятов S. aureus spp .; отбор перспективных штаммов бактерий B. subtilis для конструирования кормовой добавки.

Объекты и методы. Исследование проведено на базе лаборатории по разработке микробных препаратов Якутского НИИСХ им. М.Г. Сафронова. Изучены антагонистические активности шести штаммов бактерий B. subtilis из рабочей коллекции микроорганизмов лаборатории по разработке микробных препаратов под следующими наименованиями: B. subtilis 24-23/к, B. subtilis 27-7/1л, B. subtilis 36-3/1L, B. Subtilis 5-1/2к, B. subtilis 11-4/1к и B. subtilis 3-1/1к , – выделенных из микробиоты диких копытных животных Якутии. Исследуемые штаммы бактерий B. subtilis молекулярно-генетически идентифицированы в центре коллективного пользования «Геномика» Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).

В качестве тест-культур использованы изо-ляты S. aureus spp . ( S. aureus 3.5 spp . выделен из абортированного плода жеребенка, S. aureus

A spp . выделен из микробиоты дикой перелетной птицы), изолят E. coli A spp . (выделен из микробиоты дикой перелетной птицы) и штамм бактерий Salmonella enteritidis 13076.

Антагонистическую активность штаммов бактерий B. subtilis в отношении условно-патогенных микроорганизмов, таких как S. aureus , E. coli и S. enteritidis, исследовали методом перпендикулярных штрихов в соответствии с МУК 4.2.260210 «Методические указания по системе предре-гистрационного доклинического изучения безопасности препаратов: отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков».

Исследования по отбору перспективных штаммов в качестве основы пробиотической кормовой добавки проведены в два этапа:

1-й этап состоит из исследований антагонистической активности шести штаммов бактерий B. Subtilis, из которых выбраны наиболее сильные антагонисты условно-патогенных микроорганизмов;

2-й этап – посев на экспериментальную питательную среду и оценка влияния ее на антагонистическую активность отобранных штаммов бактерий B. subtilis в отношении двух изолятов S. aureus spp .

Экспериментальная среда состоит из 3 %-го овсяного отвара с добавлением 1 % NaCl. На данную питательную среду получен патент РФ на изобретение RU2822434C1 «Питательная среда для культивирования штаммов бактерий

Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5». Разработанная питательная среда представляет собой безотходную технологию получения кормовой добавки (питательная среда + B. Sub-tilis – готовая кормовая добавка). Оценивали возможности создания кормовых добавок по данной технологии, в соответствии с чем изучили влияние среды на антагонистическую активность отобранных четырех штаммов бактерий B. subtilis в отношении к S. aureus.

Метод перпендикулярных штрихов . Из 3-суточных культур B. subtilis готовили взвесь по стандарту мутности 10 МЕ и высевали ее штрихом по диаметру чашки Петри на подсушенный в течение 24 ч мясопептонный агар (МПА). Культивировали при температуре 37 °С в течение 48 ч. Затем перпендикулярно от края чашки к штриху выросшей культуры бацилл подсевали суточные тест-культуры по стандарту мутности, равные 5 МЕ. Чашки вновь культивировали при температуре 37 °С в течение 24 ч.

Учет результатов антагонистической активности производили по зоне ингибирования тест-культур на границе со штрихом роста Bacillus . Зоны ингибирования измерялись с помощью линейки, и их размеры фиксировались для дальнейшего анализа. Контролем роста тест-культур S. aureus , E. coli и S. enteritidis служили параллельные посевы на чашки Петри без исследуемых штаммов бактерий B. subtilis .

Результаты и их обсуждение. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты исследования антагонистической активности штаммов бактерий B. subtilis Results of the study of antagonistic activity of B. subtilis bacterial strains

Исследуемый штамм бактерий B. subtilis	Зона задержки роста тест-штаммов, мм
	S. aureus A spp.	S. aureus 3.5 spp.	E. coli А spp.	S. enteritidis 13076
24-23/к	17	8	7	–
27-7/1л	14	13	6	–
36-3/1L	12	17	3	1
5-1/2к	11	13	7	1
11-4/1к	18	15	7	0,5
3-1/1к	12	11	2	1

Представленные в таблице 1 параметры зоны задержки роста показывают, что штаммы бактерий B. subtilis обладают различной степенью антагонистической активности по отноше- нию к исследуемым тест-культурам Staphylococcus aureus spp., Escherichia coli spp. и Salmonella enteritidis 13076.

Антагонизм в отношении Staphylococcus aureus A spp . проявился в зонах задержки роста от 11 до 18 мм. Наибольший эффект наблюдался у штамма бактерий B. subtilis 11-4/1к (18 мм), в то время как штамм бактерий B. subtilis 5-1/2к показал наименьшую зону задержки роста (11 мм).

При тестировании на Staphylococcus aureus 3.5 spp. результаты варьировали от 8 до 17 мм. Наибольшую зону задержки роста показал штамм бактерий B. subtilis 36-3/1L (17 мм), в то время как самый низкий показатель – у штамма бактерий B. subtilis 24-23/к (8 мм).

Для Escherichia coli A spp . результаты оказались наиболее неоднородными, с зонами задержки роста от 2 до 7 мм. Максимальная задержка роста зафиксирована у штаммов бактерий B. subtilis 24-23/к, B. subtilis 5-1/2к и B. Sub-tilis 11-4/1к (7 мм), в то время как минимальная – у штамма бактерий B. subtilis 3-1/1к (2 мм).

Антагонизм по отношению к S. enteritidis 13076 у штаммов бактерий B. subtilis отсутствует или проявляется в слабой степени (от 0,5 до 1 мм). Отсутствие антагонизма к S. enteritidis можно объяснить утратой качественных свойств при длительном культивировании на селективных средах по сравнению со свежевыделенными изолятами. Это указывает на то, что не все штаммы B. subtilis одинаково эффективны против всех патогенных микроорганизмов и что существуют определенные ограничения в их использовании.

Результаты нашего исследования подтверждают данные, представленные в научной литературе, где указано, что штаммы бактерий B. subtilis демонстрируют выраженную антагонистическую активность в отношении различных патогенных микроорганизмов, включая S. aureus и E. coli . В работе А.А. Леляк с соавторами [18] сообщается о высокой эффективности природных сибирских штаммов бактерий Bacillus. Sub-tilis , Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus lichenifor-mis в подавлении роста S. aureus , что согласуется с нашими наблюдениями.

Антагонистическая активность B. subtilis в отношении Escherichia coli может варьироваться от средней или слабой выраженности до полного отсутствия согласно данным литературы. E. coli является естественным представителем нормальной флоры кишечника, и его влияние на здоровье может зависеть от серотипа [19, 20]. Эти данные согласуются с нашими результатами, которые также показывают, что антагонис- тическая активность B. subtilis по отношению к E. coli может быть менее выраженной.

Известно, что штаммы бактерий B. subtilis 2СП B-14405 и B. subtilis 5СП B-14406, аналогично выделенные из микробиоты диких животных Якутии и обладающие амилазной и ксиланазной активностями, также демонстрировали выраженный антагонизм против S. aureus . Что касается Sal. abortus equi , Sal.enterica и E. coli , антагонистическое действие не наблюдалось, за исключением небольших зон угнетения размером 1–2 мм, что схоже с нашими данными [21].

Исходя из полученных данных, выбраны четыре штамма бактерий B. subtilis : B. subtilis 27-7/1л, B. subtilis 36-3/1L, B. subtilis 5-1/2к, B. subtilis 11-4/1к для следующего этапа опытов. Исключили B. subtilis 24-23/к и B. subtilis 3-1/1к из-за низких показателей по Staphylococcus aureus и Escherichia coli.

Отобранные штаммы бактерий B. subtilis культивировали на экспериментальной жидкой среде в шейкер-инкубаторе «ES-20» при скорости вращения 230 об/мин и температуре 37 °C в течение 72 ч. После этого культуры пересевали штрихом на мясопептонный агар в чашках Петри и инкубировали в течение 24 ч. Готовили взвеси тест-культур и аналогичным образом пересевали перпендикулярными штрихами к выросшим культурам B. subtilis , оценивая их антагонистические активности по отношению к двум изолятам S. aureus . Результаты антагонистической активности штаммов бактерий B. Sub-tilis, выращенных на жидкой экспериментальной среде, представлены в таблице 2.

Анализируя результаты антагонистической активности штаммов Bacillus subtilis , выращенных на 3 % овсяном отваре с добавлением 1 % NaCl, можно отметить, что все исследуемые штаммы продемонстрировали выраженный антагонизм в отношении обеих Staphylococcus aureus от 10 до 13 мм. Наиболее выраженный эффект наблюдается у штамма бактерий B. sub-tilis 27-7/1л, который проявляет задержку обоих тест-штаммов на уровне 12 мм. Это свидетельствует о его сильных антагонистических свойствах и, возможно, наличии в его метаболических продуктах антимикробных соединений. В то же время меньшие зоны задержки роста у других штаммов, таких как B. subtilis 36-3/1L и B. subtilis 5-1/2к, показывают, что не все штаммы обладают одинаковой активностью.

Таблица 2

Антагонистические активности штаммов бактерий выращенных на 3 % овсяном отваре с добавлением 1 % NaCl

Antagonistic activity of bacterial strains grown on 3 % oat broth with the addition of 1 % NaCl

Исследуемый штамм Bacillus subtilis	Зоны задержки роста тест-культур, мм
	Staphylococcus aureus A spp.	Staphylococcus aureus 3.5 spp.
27-7/1л	12	12
36-3/1L	10	13
5-1/2к	10	13
11-4/1к	11	13

Однако стоит отметить, что подавляющее воздействие штаммов бактерий Bacillus subtilis на Staphylococcus aureus 3.5 spp. (12–13 мм) в целом выше, чем на Staphylococcus aureus A spp. (10–12 мм). Это может свидетельствовать о разной восприимчивости этих возбудителей к антагонистическим веществам, продуцируемым штаммами Bacillus subtilis .

Эти результаты поднимают интересные вопросы о механизмах антагонистической активности штаммов B. subtilis . Из представленных данных сделан вывод, что экспериментальная питательная среда не стимулирует выработку метаболитов, ответственных за антагонизм. Работа по разработке питательных сред продолжается, поскольку улучшение условий выращивания и оптимизация состава питательных сред могут повысить эффективность штаммов.

Исследование С.А. Лазарева с соавторами [22] рассматривает влияние источников белка и углеводов на рост и функциональные свойства двух штаммов пробиотических бактерий B. Subti-lis , обладающих высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенных микроорганизмов. В работе анализируются штаммы B. subtilis 1719 и B. subtilis 3H. Оптимальный состав питательной среды оказывает значительное влияние на биосинтетическую активность и накопление вторичных метаболитов. На основе экспериментов был разработан питательный состав, обеспечивающий максимальный выход биомассы и антимикробную активность вторичных метаболитов.

Авторы также исследовали антимикробные и ферментативные свойства метаболитов, полученных в результате глубокого культивирования штаммов B. subtilis 1719 и B. subtilis 3H. Было обнаружено, что антимикробная активность ме- таболитов сосредоточена во фракции с молекулярной массой менее 5 кДа и проявляет специфические особенности для каждого штамма. Метаболиты B. subtilis 3H наиболее активны в отношении бактерий S. aureus FDA 209P и C. albicans 927, в то время как метаболиты B. subtilis 1719 демонстрируют наибольшую активность в отношении тестируемых штаммов P. mirabilis 24a и E. coli ATCC 25922 [23].

Данные, представленные авторами, демонстрируют актуальность разработки питательных сред для B. subtilis . Наши исследования согласуются с этими результатами, поскольку и другие ученые рассматривают аналогичные вопросы, связанные с культивированием и улучшением свойств микроорганизмов.

Исходя из полученных данных, выбраны два перспективных штамма бактерий: B. subtilis 11-4/1к и B. subtilis 27-7/1л, которые продемонстрировали наибольшую антимикробную активность против Staphylococcus aureus и средние показатели против Escherichia coli , как показано на рисунке.

Полученные данные, отраженные на рисунке, демонстрируют антагонистическую активность штаммов бактерий B. subtilis 27-7/1л и B. subtilis 11-4/1к как перспективных для разработки пробиотических добавок. Эти штаммы прошли международное патентное депонирование в Биоресурсном центре – Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БЦР ВКПМ) Национального исследовательского центра «Курчатовский институт». Международным депозитарным органом штаммам бактерий присвоены регистрационные номера: B. subtilis 27L VKPM B-14800, дата депонирования 06.09.2024, B. subtilis 11K VKPM B – 14816, дата депонирования 06.09.2024.

Антагонистическая активность штаммов бактерий B. subtilis 27-7/1л и B. subtilis 11-4/1к:

А – Staphylococcus aureus 3.5 spp.; Б – Salmonella enteritidis 13076; В – Escherichia coli А spp.;

Г – Staphylococcus aureus A spp.; Д – B. subtilis 27-7/1л; Е – B. subtilis 11-4/1к

Antagonism of promising bacterial strains B. subtilis 27-7/1l and B. subtilis 11-4/1k: A – Staphylococcus aureus 3.5 spp.; Б – Salmonella enteritidis 13076; В – Escherichia coli A spp.; Г – Staphylococcus aureus A spp.; Д – B. subtilis 27-7/1l; E – B. subtilis 11-4/1k

Таким образом, результаты представленных исследований подтверждают высокий потенциал штаммов бактерий B. subtilis для использования в составе пробиотических кормовых добавок.

Заключение. Полученные в ходе исследования результаты показывают, что штаммы бактерий B. subtilis , выделенные из микробиоты диких копытных животных Якутии, обладают значительным потенциалом в борьбе с S. aureus и E. coli . При проведении опытов по определению антагонистической активности шести штаммов бактерий B. subtilis отмечена высокая (от 11 до 18 мм) и средняя (8 мм) активность против St. aureus spp ., а также средняя (6–7 мм) и слабая (2 мм) активность против E. coli spp . и отсутствие антагонизма по отношению к S. enteritidis 13076: у штаммов бактерий B. subtilis антагонизм отсутствует или проявляется в слабой степени (от 0,5 до 1 мм).

Для дальнейшего изучения выбрали два перспективных штамма бактерий: B. subtilis 11-4/1к и B. subtilis 27-7/1л, которые показали наибольшую антимикробную активность против Staphylococcus aureus и средние показатели против Escherichia coli . Эти штаммы представляют большой интерес для разработки пробиотической добавки, поскольку их антагонистические свойства наиболее стабильны независимо от влияния сред для повышения устойчивости животных к инфекционным заболеваниям.

Разработка пробиотических добавок на основе B. subtilis, выделенных из микробиоты ди- ких копытных животных Якутии, представляет собой перспективное направление, способствующее повышению безопасности и качества продуктов питания, а также улучшению общего здоровья животных. Пробиотики играют важную роль в поддержании нормального баланса микрофлоры кишечника, что влияет на пищеварение и усвоение питательных веществ.

Потенциал B. subtilis также включает в себя их способность к продукции бактерицидных веществ, таких как антибиотики и антимикробные пептиды, которые могут быть использованы для создания новых биопрепаратов. Эти свойства делают штаммы B. subtilis выгодными не только с точки зрения снижения заболеваемости животных, но и с точки зрения повышения производительности животноводства. Эффективное использование пробиотических добавок может привести к улучшению прироста массы животных, повышению их стойкости к стрессовым условиям и улучшению качества мясных и молочных продуктов.

Результаты нашего исследования подчеркивают важность изучения штаммов B. subtilis как перспективных кандидатов для разработки пробиотических добавок. Их применение может стать значимым вкладом в устойчивое развитие животноводства и обеспечение безопасности продуктов питания, что особенно актуально в условиях растущего спроса на экологически чистые и безопасные продукты.