Антиагрегантная терапия парвовирусного энтерита у собак в возрасте от 2 до 6 месяцев

Актуальность

Парвовирусная инфекция плотоядных вызывается ДНК-содержащим вирусом, широко распространена и вызывает тяжелое, угрожающее жизни состояние [1, 2, 3, 4]. Наиболее восприимчивы собаки в возрасте от 2 месяцев до 1 года [2, 4, 5] Летальность зависит от возраста животного и тяжести течения болезни. У молодых животных она колеблется от 5 до 100%, а у взрослых собак не превышает 1% [5].

Парвовирусная инфекция собак у щенков в возрасте от 2 до 6 месяцев клинически проявляется наиболее тяжело, при этом на третий день болезни уменьшается количество тромбоцитов и индекс дезагрегации тромбоцитов под действием ристо-мицина, что говорит о высокой активности сосудистого компонента и образовании более прочных агрегатов. На пятый день болезни происходит прогрессирующее уменьшение количества тромбоцитов вместе с понижением тромбокрита и повышением объема тромбоцита, уменьшается дезагрегация тромбоцитов под действием коллагена и ристомицина, что является признаком повышения функциональной активности тромбоцитов, а в частности, ее сосудистого компонента. Возможно это связано с тем, что клетки – предшественники тромбоцитов в костном мозге у собак в возрасте младше 6 месяцев более уязвимы для парвовируса. [6, 7].

Медицинские исследования показывают, что в период вирусемии выделяются биологически активные вещества, которые способствуют повышению проницаемости сосудов микроциркуляторного русла и приводят к расширению микрососудов. Среди патологических изменений в системе микроциркуляции особого внимания заслуживают внутрисосудистые расстройства, так как именно они приводят к ухудшению кровоснабжения жизненно важных органов, развитию ишемических и некротических процессов. Если в физиологических условиях тромбоциты могут играть защитную роль в отношении эндотелия, то во время вирусных инфекций они способствуют еще большему повреждению сосудистой стенки. В экспериментах на животных показано, что тромбоцитарные агрегаты, появляясь в микроцир-куляторном русле, способны повреждать нормальную сосудистую стенку, вызывая тем самым развитие васкулита [7, 8, 9].

Такие патоморфологические признаки, как обширные участки некроза в кишечнике, серозно-геморрагический лимфаденит с мелкоточечными кровоизлияниями, геморрагические инфаркты в селезенке у 3 щенков, серозно-геморрагический перикардит с участком некроза миокарда около 2 см в диаметре у 1 щенка, отек легких с крупноточечными кровоизлияниями под плеврой у 12 щенков, выявленные В.И. Балабановой при вскрытии 25 щенков, погибших от парвовирусной инфекции, ярко иллюстрируют наличие гемореологических нарушений [5, 7].

При инфекционных заболеваниях внутрисосудистое свертывание возникает под воздействием эндотоксинов, комплексов антиген-антитело, а также в результате непосредственного повреждения эндотелия сосудов инфекционными агентами [8, 9], однако исследований по фармакологической коррекции нарушений гемостаза при парвовирусном энтерите плотоядных мы не обнаружили ни в одном из доступных источников информации.

Поэтому целью нашей работы стало исследование возможности применения антиагрегантной терапии при парвовирусном энтерите у собак в возрасте от 2 до 6 месяцев.

Антиагреганты – вещества, действующие на сосудисто-тромбоцитарное звено системы гемостаза, но некоторые препараты этой группы (ацетилсалициловая кислота, клопидогрел) негативно действуют на слизистую оболочку желудочно- кишечного тракта [10], поэтому препаратом выбора стал пентоксифиллин. Он ингибирует фосфодиэстеразу, стабилизирует цАМФ и снижает концентрацию внутриклеточного кальция, блокирует АДФ рецепторы, за счет чего тормозит агрегацию тромбоцитов, повышает их устойчивость к деформации, подавляет тромбообра-зование и нормализует микроциркуляцию, при этом вызывает вазодилятацию сосудов сердца и легких. Пентоксифиллин широко используется при нарушениях микроциркуляции крови, сопровожающих самые разнообразные заболевания у животных [11, 12, 13]. В комплексе с пентоксифиллином было решено использовать реополиглюкин – это декстран, биологическим свойством которого является связывание воды и увеличение длительности пребывания коллоидных частиц в сосудистом русле, что полезно при нарастающих признаках дегидратации и, как следствие, повышения вязкости крови. Кроме того, декстраны обладают свойствами дезагрегации тромбоцитов и эритроцитов, что препятствует агглютинации и образованию сладжей [7, 14].

Материалы и методы

Исследования, положенные в основу работы, выполнены в 2013–2018 гг. на собаках в возрасте от 2 до 6 месяцев, принадлежащих Вологодскому обществу защиты животных «Велес». Лабораторные исследования проведены на базе кафедры внутренних незаразных болезней, хирургии и акушерства Вологодской ГМХА [7].

Исследовали 30 собак в возрасте от 2 до 6 месяцев, которым был поставлен диагноз «парвовирусная инфекция плотоядных», диагноз ставили с помощью клинического осмотра и выявления антигена парвовируса в фекалиях собак хроматографическим иммунохимическим методом с использованием одношагового экспресс-теста VetExpert CPV Ag. Из этих животных случайным образом были сформированы 2 группы.

Собакам 1 группы (Опыт 1, n=15 собак) применялась стандартизированная терапия, включающая введение раствора Рингера-Локка 30‒60 мл/кг в сутки с целью регидратации, дезинтоксикации и восполнения электролитов, ампициллин 20‒40 мг/кг/каждые 8 часов внутривенно для профилактики бактериальной инфекции. Рвоту купировали с помощью подкожного введения маропитанта цитрата (Серения) в дозе 1 мг/10 кг каждые 24 часа первые 3‒5 дней болезни [7, 15]. После купирования рвоты применяли Энтеросгель по 2‒5 г 6 раз в сутки перорально и диетический рацион Роял Канин Рекавери (примерно по 1 ст. ложке 6 раз в сутки). В качестве специфической терапии применяли сыворотку Гискан-5 в дозе 1-2 мл на животное подкожно, трехкратно с интервалом 24 часа [7].

Собакам 2 группы (Опыт 2, n =15 собак), помимо приведенной выше базисной терапии, с момента появления первых клинических симптомов применялась антиагрегантная терапия, включающая реополиглюкин (10 мл/кг, внутривенно, медленно, через день 3 инъекции) и пентоксифиллин (0,1 г (5 мл раствора) разводится в 250‒500 мл изотонического раствора натрия хлорида, вводится из расчета 20 мг/кг, длительность введения – 90‒180 минут внутривенно капельно, ежедневно в течение 5 дней). Полученные результаты сравнивали с первой группой щенков (Опыт 1, n = 15 собак). Погибло 5 собак – 4 щенка в 1-й опытной группе и 1 щенок во 2-й опытной группе. В качестве контрольных цифр использовались данные более ранних исследований здоровых собак этой же возрастной группы, проведенные в этой же лаборатории, на том же оборудовании [7, 15].

У животных опытных групп определяли морфологические и гемостатические показатели на 3-й и 5-й дни болезни с момента появления клинических признаков.

Для морфологического исследования крови использовали вакуумные пластиковые пробирки с ЭДТА. Подсчет форменных элементов крови, определение уровня тром-бокрита (PCT) и среднего объема тромбоцита (MPV), количество гемоглобина (HGB, Hb) и гематокрита (HCT) производили с помощью автоматического гематологического анализатора Exigo 17 (Boule Medical A.B., Швеция). Однако при подсчете тромбоцитов с наличием атипичных форм и тромбоцитарных агрегатов, а также у кошек, автоматические счетчики могут давать искаженную информацию [17, 18], поэтому количество тромбоцитов и лейкоцитарную формулу подсчитывали вручную в мазке крови, окрашенной по Романовскому – Гимзе. Кровь для гемостазио-логического исследования брали в вакуумные пластиковые пробирки, содержащие 3,8% раствор цитрата натрия. С помощью центрифугирования получали обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) и бедную тромбоцитами плазму (БТП) [7].

Адгезивно-агрегационную активность тромбоцитов определяли количественным методом с применением фотоэлектроколориметра (ФЭК) КФК-2 по Howard M. A [19]. Определяли суммирующий индекс агрегации тромбоцитов (СИАТ), скорость агрегации (СА) и индекс дезагрегации тромбоцитов (ИДТ) с индукторами агрегации – АДФ (концентрация 0,1 мг/мл), коллагеном (концентрация 20 мг/мл) и ристо-мицином (концентрация 15 мг/мл) [7].

Параметры плазменно-коагуляционного гемостаза определяли на коагуломе-тре Thrombostat производства Behnk Elektronik (Германия) с использованием цитратной бестромбоцитной плазмы после добавления различных реактивов производства фирмы «Технология-Стандарт» и НПО «РЕНАМ». Для оценки состояния плазменно-коагуляционного гемостаза выбрали следующие показатели: АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время); ПВ (протромбиновое время); ТВ (тромбиновое время); количественный анализ фибриногена. Количество растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) определяли с помощью планшетного варианта ортофенантролинового теста. Активность антитромбина определяли с помощью «Тех-Антитромбин-теста» (принцип U. Abildgaard в модификации А.П. Момота и А.Н. Мамаева) [7, 20].

Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались с помощью программного пакета Statistica 6.1. Значения полученных результатов в работе представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (M ± m). Результаты исследования со значением вероятности допущения альфа-ошибки, равные либо менее 5% (р ≤ 0,05) расценивались как статистически значимые. Сравнение независимых выборок проводили с помощью критерия Манна – Уитни, зависимых ‒ с помощью критерия Вилкоксона [7].

Результаты исследования

Морфологические параметры крови претерпели изменения у собак в обеих опытных группах, однако различий между группами выявлено немного (табл. 1). Количество лейкоцитов в первой группе уменьшилось немного сильнее, чем во второй, но достоверной разницы эти различия не имели. Уровень палочкоядерных нейтрофилов, относительно контрольных цифр, повысился в обеих группах, но во второй незначительно больше [7].

Единственное, что достоверно различало исследуемые группы ‒ это уровень лимфоцитов, который во второй группе уже на третий день был выше, чем в первой (р=0,0035) и сохранился на этом уровне до 5-го дня болезни (р=0,04), тогда как у собак первой группы на 5-й день уровень лимфоцитов понизился ниже контрольных значений [7].

Таблица 1 ‒ Лейкоцитарные показатели у собак опытных групп, M ± m.

ПпкЛЭДТРПк		Контроль,	Опыт 1, n = 1	5	Опыт 2, n =	5
Ед.	, измерения	n = 10	3 день	5 день	3 день	5 день
Количество лейкоцитов, х109/л		12,51±0,65	7,91±1,38	9,32±2,15	9,44±1,72	12,12±2,33
ч0 о4 ? Z Q. О е о у Ф с;	Сегментоядерные нейтрофилы	57,0±1,04	46,8±2,75	49,9±2,32	47,83±1,05	50,5±3,51
	Палочкоядерные нейтрофилы	2,20±0,46	9,1±2,39	10,5±1,84	10,11±1,51	11,72±1,5
	Моноциты	8,60±0,60	7,4±0,87	9,4±0,49	8,55±1,61	9,64±1,8
	Лимфоциты	27,00±1,4	29,4±1,68	24,6±2,53	39,21±5,08	32,91±1,39
	Эозинофилы	5,10±0,70	4,5±1,27	5,6±1,27	4,5±1,72	5,18±1,75
	Базофилы	0,50±0,16	1,4±0,75	0,3±0,2	0,42±0,17	0,53±0,16

Количество эритроцитов во второй группе осталось на уровне контроля, тогда как в первой группе щенков незначительно уменьшилось (табл. 2) . Количество гемоглобина у собак второй группы на 5-й день болезни немного повышается (р=0,021) в отличие их от собак первой группы, где количество гемоглобина снижается. Изменения уровня гематокрита при этом у собак обеих групп существенной разницы не имеют [7].

Изменения тромбоцитарных параметров у собак опытных групп существенно отличаются. У собак второй группы, которым применяли антиагрегационную терапию, не происходит существенного понижения количества тромбоцитов, тогда как в первой группе количество тромбоцитов на 5-й день достоверно понижается, что приводит к различиям между группами (р=0,015) [7].

Таблица 2 ‒ Эритроцитарные и тромбоцитарные показатели у собак опытных групп, M ± m.

Показатель, Ед. измерения	Контроль, n = 10	Опыт 1, n = 15		Опыт 2, n = 15
		3 день	5 день	3 день	5 день
Эритроциты, х10 12/л	6,39±0,29	5,26±0,5	5,14±0,55	6,23±1,5	6,91±1,35
Гемоглобин, г/л	131,31±6,13	137,72±7,31	117,62±3,47	129,3±8,13	137,62±13,17
Гематокрит, %	0,41±0,02	0,4±0,05	0,36±0,07	0,43±0,05	0,37±0,07
СОЭ, мм/ч	3,55±0,48	6,4±1,02	5,6±0,5	5,23±0,29	4,45±1,32
Тромбоциты, х10 9/л	405,77±3,11	349,62±25,69	306,2±40,38	361,32±37,16	352,7±25,41
Тромбокрит,%	0,35±0,03	0,47±0,06	0,28±0,06	0,37±0,05	0,38±0,03
Ср. объем тромбоцита, fl	7,5±0,9	6,9±1,2	8,3±1,5	6,9±0,8	7,2±1,1

Уровень тромбокрита изменяется похожим образом, и на 5-й день у собак первой группы, в отличие от второй, наблюдают его понижение (р=0,017). При этом у собак первой группы слегка увеличивается средний объем тромбоцита, но к существенным различиям со второй группой и контролем это не приводит [7].

Антиагреганты – вещества, действующие на сосудисто-тромбоцитарное звено системы гемостаза, поэтому большая часть различий между группами была в параметрах тромбоцитарных функций (табл. 3) .

Таблица 3 ‒ Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз у собак опытных групп

Показатель Ед. изм.	Контроль, n = 10	Опыт 1, n = 15, M ± m		Опыт 2, n = 15, M ± m
		3 день	5 день	3 день	5 день
Агрегация с АДФ
СИАТ,%	92,96±10,23	108,32±13,90	110,92±12,91	50,12±8,3	45,35±15,83
СА, мин	0,01±0,0026	0,0097±0,004	0,0151±0,0037	0,016±0,004	0,016±0,0029
ИДТ,%	5,3 ±1,19	4,82±2,1	7,06±3,22	5,75±0,3	7,12±1,3
Агрегация с коллагеном
СИАТ,%	114,01±12,05	126,64±15,64	105,32±13,62	66,71±12,37	58,29±16,32
СА, мин	0,01 ± 0,0036	0,015±0,005	0,0139±0,0066	0,017±0,006	0,019±0,007
ИДТ,%	7,15 ± 1,52	5,85±1,67	4,2±1,78	5,35±0,71	5,3±0,03
Агрегация с ристомицином
СИАТ,%	110,69±12,36	110,66±14,01	123,52±17,21	71±11,5	53,12±9,35
СА, мин	0,01±0,0028	0,0094±0,003	0,0094±0,003	0,01±0,009	0,025±0,006
ИДТ,%	5,75±1,26	2,18±0,95	0,9±0,5	5,27±0,15	3,8±0,6

У собак второй группы суммирующий индекс агрегации со всеми индукторами был достоверно ниже, чем в контрольной группе (р=0,012 с АДФ, р=0,013 с коллагеном и р=0,032 с ристомицином на 3-й день и р=0,001 с АДФ, р=0,0015 с коллагеном и р=0,001 с ристомицином на 5-й день) и второй группе (р=0,002 с АДФ, р=0,0014 с коллагеном и р=0,012 с ристомицином на 3-й день и р=0,0001 с АДФ, р=0,0013 с коллагеном и ристомицином на 5-й день). При этом параметры дезагрегации тромбоцитов практически не различались, за исключением ИДТ с ристомицином, которое значительно понизилось в первой группе и практически не изменилось во второй, что обусловило разницу между группами (р=0,0005 на 3-й день и р=0,0001 на 5-й день) и ИДТ с коллагеном, которое снизилось у собак первой группы на 5-й день болезни, а у собак второй группы статистически не отличалось от контрольных параметров. Скорость агрегации замедлилась только при индукции ристомицином во второй группе на 5-й день болезни (р=0,027) [7].

Для формирования наглядной картины изменений сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза у собак опытных групп, мы провели анализ полученных результатов в динамике. При сравнении изменений показателей гемостаза мы использовали относительные величины, при этом за 100% принимали значение показателей гемостаза у контрольной группы щенков в возрасте от 2 до 6 месяцев. В результате (рис. 1) мы видим, что во второй группе на третий день болезни произошло снижение суммирующих индексов агрегации с АДФ на 47%, с коллагеном на 42% и ристомицином на 36%, тогда как в первой группе эти параметры не изменились (СИАТ с ристомицином) или слегка повысились (СИАТ с АДФ на 16%, с коллагеном на 11%). При этом индексы дезагрегации тромбоцитов собак в обеих группах существенных изменений не претерпели, за исключением понизившегося на 63% ИДТ с ристомицином в первой группе. На пятый день болезни общая тенденция изменений сохранилась, за исключением индекса дезагрегации с АДФ, который вырос на 33% в первой и на 34% во второй группе относительно контрольных цифр [7].

Рис. 1. Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз у собак опытных групп на 3 и 5 день болезни (показатели контрольной группы приняты за 100%).

Клинические проявления у животных опытных групп были разнообразны, но не отличались от результатов других исследователей (табл. 4). Наиболее распространенными клиническими симптомами у наблюдаемых собак были апатия, диарея, рвота и дегидратация. Смертность приходилась на 5-й, реже 6-й день болезни. В 1 группе погибло 4 собаки, во второй группе – 1 собака.

Таблица 4 ‒ Клинические симптомы у животных опытных групп, %

Клинический симптом	Опыт 1, n = 15				Опыт 2, n = 15
	Выжившие, n = 11		Погибшие, n = 4		Выжившие, n = 14		Погибшие, n = 1
	3 день	5 день	3 день	5 день	3 день	5 день	3 день	5 день
Апатия	100	18	100	100	92	7	100	100
Диарея катаральная	18	100	-	-	57	92	-
Диарея геморрагическая	81	-	100	100	42	-	100	100
Рвота	100	-	50	-	100
Рвота с примесью крови	-	-	50	-	-	-	100	-
Дегидратация	27	9	100	100	14		100	100
Анемичность слизистых	45	9	100	100	35		100	100
Одышка, носовые гнойные истечения	-	-	-	-	-	-	-	100
Удлиненное время наполнения капилляров	27	-	75	100	-	-	100	100
Лихорадка	72	-	50	-	64		100	100
Гипотермия	-	-	-	100	-
Абдоминальная боль	81	-	100	75	35		100
Тромбоз венозных катетеров	27	-	100	100	-	-	100	-
Петехиальные кровоизлияния	-	-	-	-	-	-	-	100

Смертность в первой группе собак составила 26,6%, тогда как во второй группе, где применяли антиагрегантную терапию, составила 6,6% (рис. 2).

Рис. 2. Смертность в опытных группах, %

Заключение

Включение пентоксифиллина и реополиглюкина в схему лечения 2-й опытной группы щенков в возрасте от 2 до 6 месяцев позволяет сохранить уровень лимфоцитов на 3-й (39,21±5,08%) и 5-й день болезни (32,91±1,39%), количество гемоглобина (137,62±13,17г/л), тромбоцитов (352,7±25,41 х109/л) и тромбо-крит (0,38±0,03%) на 5-й день болезни на уровне контрольных цифр; приводит к снижению агрегационных свойств тромбоцитов, которое проявляется уменьшением суммирующего индекса агрегации со всеми индукторами (50,12±8,3 % с АДФ, 66,71±12,37 % с коллагеном и 71±11,5 % с ристомицином на 3-й день и 45,35±15,83 % с АДФ, 58,29±16,32 % с коллагеном и 53,12±9,35 % с ристомици-ном на 5-й день) и замедлением скорости агрегации с ристомицином до 0,025±0,006 мин на 5-й день болезни.

Резюмируя результаты клинической оценки, можно отметить, что включение антиагрегантной терапии в схему лечения второй опытной группы позволяет уменьшить проявления таких клинических симптомов, как геморрагическая диарея (на 39% на 3-й день и 100% на 5-й день болезни); дегидратация (на 14% на 3-й день и 9% на 5-й день болезни); анемия на 10% и удлинение СНК на 27%; абдоминальная боль на 46% и тромбозы венозных катетеров на 27% на 3-й день болезни, что позволяет снизить смертность на 20% относительно группы с базовой схемой лечения.

Основываясь на полученных результатах, можно заключить, что введение в схему лечения парвовирусной инфекции антиагрегантных препаратов – пентоксифиллина и реополиглюкина – позволяет добиться положительной динамики агрегационных параметров тромбоцитов, предупредить тяжелые осложнения, связанные с нарушением гемодинамики, за счет чего снизить смертность у собак, больных парвовирусной инфекцией.