Антибиотикорезистентность грамотрицательных микроорганизмов, циркулирующих у животных Омской области

Основной причиной многих инфекционных болезней животных и человека являются грамотрицательные бактерии, среди которых лидирующие позиции занимают представители семейства Enterobacteriaceae и неферментирующие грамотрицательные бактерии – Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa [8]. Также грамотрицательные бактерии обладают высоким уровнем резистентности к большому количеству антимикробных препаратов. При этом арсенал антибиотиков, эффективных в отношении грамотрицательных бактерий, на сегодняшний день ограничен [3]. Основная проблема антибиотикорезистентности заключается в ненадлежащем использовании антибиотических препаратов, способствующих возникновению резистентностных штаммов [1].

Резистентность к антимикробным препаратам возрастает до угрожающе высоких уровней во всем мире, угрожая возможности врачей и ветеринарных специалистов бороться с инфекционными заболеваниями из-за снижения эффективности антибиотиков [7]. Основные подходы к лечению и профилактике бактериальных инфекций заключаются в эффективной диагностике, постоянном совершенствовании в области антимикробной терапии [5]. По научным данным, бактерия вырабатывает устойчивость за 2-3 года, тогда как разработка и испытания нового АМП длится около 5 лет [7].

Антибиотикорезистентность всегда обусловлена генетически и возникает за счет изменения собственных генов или приобретения новых, а также изменения уровня экспрессии уже имеющихся генов [4]. Резистентность грамотрицательных бактерий опосредована активностью β-лактамаз, направленные на борьбу с β-лактамными антибиотиками, одними из самых часто применяемых препаратов для лечения инфекционных заболеваний [4, 8].

В        настоящее        время антибиотикорезистентные       бактерии признаны новым классом антропогенных биологических поллютантов, которые способны накапливаться в окружающей среде и представлять угрозу для здоровья человека.      Антибиотикорезистентные бактерии и антибиотикорезистентные гены обычно обнаруживают в отходах после использования концентрированных кормов для сельскохозяйственных животных, стоках животноводческих предприятий и навозе животных.

В связи с появлением и широким распространением антибиотикорезистентности у бактерий, определение           чувствительности микроорганизмов-возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных     к     антибактериальным препаратам приобретает все более важное значение [9].

ВОЗ на основе научных данных по антибиотикорезистентности с целью охраны здоровья и окружающей среды разработаны      рекомендации      по организации исследований для изучения уровня распространения стойких к антибиотикам бактерий в окружающей среде, в том числе в объектах животноводческих ферм для того, чтобы эффективно               разрабатывать профилактические меры [2].

Цель    работы    –    изучить антибиотикорезистентность грамотрицательных бактерий, выделенных из клинического и патологического материала животных Омской области, к антимикробным препаратам.

Материал      и      методы исследований.    Для    исследования использовали клинический (ректальные смывы, пробы фекалий) и патологический (абортированный плоды, внутренние органы) материал, полученный от животных Омска и Омской области за 2021      год.      Бактериологические исследования проводили на базе БУ «Омская     областная     ветеринарная лаборатория» в бактериологическом отделе. Исследовали 68 проб от животных, а именно от сельскохозяйственных животных (n=32), плотоядных (n=23) и других    (n=13).    Индикацию    и идентификацию            выделенных микроорганизмов проводили, пользуясь общепринятыми    в    микробиологии методами. Посев исследуемого материала осуществляли     на     простые     и дифференциально-диагностические питательные среды. Морфологические и тинкториальные свойства изучали путем приготовления        мазков-препаратов, окрашенных по Граму. Сахаролитическую активность устанавливали при посеве выделенных культур в полужидкие среды Гисса с углеводами. Серологическую идентификацию кишечной палочки проводили      с      использованием агглютинирующих О-коли сывороток. По результатам проведенных исследований делали заключение о родовой и видовой принадлежности выделенных микробов.

Определение    чувствительности выделенных культур к антибактериальным препаратам различных фармакологических групп осуществляли диско-диффузионным методом на среде АГВ с использованием коммерческих дисков с антибиотиками. В работе использовали набор стандартных дисков промышленного производства (ЗАО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», Санкт-Петербург) для ветеринарных лабораторий. Набор включает диски со следующими противомикробными препаратами, в число которых входили группы тетрациклина (доксициклин, тетрациклин), аминогликозиды (гентамицин, канамицин), фторхинолоны (пефлоксацин), цефалоспорины (цефуроксим).

Учет результатов проводили, измеряя диаметр зон задержки роста микроорганизмов. Результаты исследования сравнивали с пограничными значениями этих параметров, отделяющих чувствительные штаммы от промежуточных и промежуточные от устойчивых в соответствии с МУК 4.2.1890-4 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» [5].

Результат исследований. Из всех 68 проб было выделено 73 культуры грамотрицательных бактерий, которые чаще всего выделяли от сельскохозяйственных животных, среди них КРС – 22 культуры, лошади – пять культур, кролики – четыре культуры и МРС – три культуры. Что касается плотоядных животных, то 15 культур были выделены от собак, а 11 культур – от кошек. Прочие животные представлены приматами и рептилиями в количестве семи и шести культур, соответственно. У сельскохозяйственных животных грамотрицательные бактерии представлены пятью родами: Escherichia (44,1 %), Proteus (23,5 %), Pseudomonas (17,6 %), Salmonella (11,8 %) и Enterobacter (2,9 %). У непродуктивных животных микробный пейзаж более разнообразный и состоит из следующих родов: Escherichia (23,1 %), Proteus (23,1 %), Pseudomonas (19,2 %), Enterobacter (11,5 %), Hafnia (7,7 %), Citrobacter (7,7 %) и Morganella (7,7 %). У рептилий и приматов были выделены только микроорганизмы рода Salmonella

(100 %) (Таблица 1).

Таблица 1 – Выделенный спектр микроорганизмов из клинического и патологического материалов от животных Омска и Омской области за 2021 г.

Виды микроорганизмов	Сельскохозяйственные животные				Непродуктивные животные		Другие животные		Итого
	и Ph	re 3 о	s о a	и Ph s	s re о о	s о и	S Й 3 к	S R к н с
E. coli	11	1	-	3	3	3	-	-	21
Salmonella spp.	-	-	4	-	-	-	7	6	17
P. aeruginosa	6	-	-	-	2	3	-	-	11
P.mirabilis	4	1	-	-	3	1	-	-	9
P. vulgaris	-	3	-	-	1	1	-	-	5
E.cloacae	1	-	-	-	1	1	-	-	3
Hafnia spp.	-	-	-	-	-	2	-	-	2
C.freundii	-	-	-	-	2	-	-	-	2
M.morganii	-	-	-	-	2	-	-	-	2
E.aerogenes	-	-	-	-	1	-	-	-	1
Всего:	22	5	4	3	15	11	7	6	73

E.coli

• ■    Salmonella spp.

• ■    Ps.aeroginosa

• ■    Pr.mirabilis

• ■    Pr. vulgaris

• ■    Enterobacter cloacae

• ■    Hafiiia spp.

• ■    Citrobacter fieundii

• ■    M organella morganii

• ■    Enterobacter aerogenes

Рисунок 1  – Видовой спектр выделенных микроорганизмов из клинического и патологического материалов различных видов животных за 2021 г., %

По полученным результатам исследований можно отметить, что среди изученных грамотрицательных бактерий чаще выделяли Escherichia coli – 28,8 % (n=21), Salmonella spp. – 23,3 % (n=17),

Pseudomonas aeruginosa ‒ 15 % (n=11), Proteus mirabilis – 12,3 % (n=9), Proteus vulgaris – 6,9 % (n=5), Enterobacter cloacae – 4,2 % (n=3), Hafnia spp. – 2,7 % (n=2), Citrobacter freundii – 2,7 % (n=2),

Morganella morganii – 2,7 % (n=2). В единичном случае был выделен Enterobacter aerogenes – 1,4 % (Рисунок 1).

У 62 животных (91,2 %) микроорганизмы выделялись в монокультуре и у 6 – в ассоциации из 2-х видов микроорганизмов (8,8 %). Монокультуры представлены следующими микроорганизмами: Escherichia coli (30,6 %), Salmonella spp. (27,4 %), Pseudomonas aeruginosa (16,1 %), Proteus mirabilis (9,7 %), Proteus vulgaris (4,8 %), Hafnia spp. (3,2 %), Citrobacter freundii (3,2 %), Enterobacter cloacae (1,6 %), Morganella morganii (1,6 %) и Enterobacter aerogenes (1,6 %).

В шести пробах (8,8 %) выделенный спектр микроорганизмов представлен двухкомпонентными ассоциациями: Proteus mirabilis + Escherichia coli (16,6 %); Proteus mirabilis + Enterobacter cloacae (16,6 %); Proteus mirabilis + Morganella morganii (16,6 %); Pseudomonas aeruginosa + Enterobacter cloacae (16,6 %); Proteus vulgaris + Escherichia coli (33,3 %). Чаще всего в составе ассоциаций присутствовали энтеробактерии рода Proteus (83,3 %) и Escherichia coli (50 %).

Для определения чувствительности выделенных грамотрицательных микроорганизмов применяли следующие антибактериальные препараты: гентамицин, доксициклин, канамицин, пефлоксацин, тетрациклин и цефуроксим.

На Рисунке 2 изображены результаты антибиотикорезистентности культур Escherichia coli к отдельным антибиотикам различных групп. Можно заметить, что 52,6 % (n=10) выделенных культур кишечной палочки чувствительны к гентамицину, относящейся к группе аминогликозидов. Соответственно, 10,5 % (n=2) культур резистентны к предложенным антибиотикам. Оставшиеся 36,8 % (n=7) культур умеренночувствительны. Кроме того, отмечена высокая устойчивость культур Escherichiacoliк доксициклину, уровень которой составил 63,2 % (n=12).

Рисунок 2 – Антибиотикорезистентность выделенных культур Escherichia coli

Что касается сальмонелл, то высокая чувствительность из изученных антибиотиковустановлена к гентамицину, которая составила 76,5 % (n=13). Процент умеренно-резистентных культур составлял 23,5 % (n=4). Соответственно, микроорганизмы рода Salmonella spp. не имеют резистентных культур к гентамицину. Наибольшая устойчивость у культур сальмонелл установлена к доксициклину – 58,8 % (n=10). Результаты изучения антибиотикорезистентности культур сальмонелл представлены на

Рисунке          3.          Исследуя антибиотикочувствительность          и антибиотикорезистентность микроорганизмов рода Proteus можно отметить, что наибольший процент исследуемых энтеробактерий – 88,9 %

(n=8)         обладают         высокой чувствительностью к гентамицину. Из этого следует, что количество резистентных форм составляет 11,1 % (n=1). Что касается резистентных форм, то наибольшее их количество принадлежит доксициклину – 66,7 % (n=6), а чувствительность составила 33,3 % (n=3), соответственно.

Рисунок 3 – Антибиотикорезистентность

Salmonella spp.

выделенных культур микроорганизмов рода

Наибольшая часть выделенных культур Pseudomonas aeruginosa чувствительна к гентамицину, что составило 80 % (n=8). К гентамицину резистентно 10 % (n=1) от всего количества выделенных культур. Оставшаяся доля приходится на условнорезистентные формы – 10 % (n=1). Pseudomonas aeruginosa, выделенная из проб, оказалась в 100 % случаев резистентна к цефуроксиму – цефалоспорину II поколения.

Энтеробактерии рода Enterobacter, а именно Enterobacter cloacae (n=1) были чувствительны к гентамицину, канамицину, пефлоксацину и тетрациклину, условно-чувствителен к доксициклину и резистентен к цефуроксиму. Другой вид из рода Enterobacter – Enterobacter aerogenes (n=1) был чувствителен ко всем применяемым антибиотикам.

Микроорганизмы рода Hafnia spp.

(n=2) были чувствительны к гентамицину, канамицину, пефлоксацину, тетрациклину и цефуроксиму, но были резистентны к доксициклину.

Выделенные культуры Citrobacter freundii (n=2) чувствительны к гентамицину; условно-чувствителены к пефлоксацину и резистентены к цефуроксиму. К доксициклину, канамицину и тетрациклину резистентна одна культура, а другая культура условночувствительна к канамицину.

Morganella morganii (n=1) чувствителен к гентамицину, доксициклину, пефлоксацину, тетрациклину и цефуроксиму, но при этом резистентна к канамицину. Результаты проведенных исследований показаны в таблице 2.

Также изучали чувствительность и резистентность бактериальных ассоциаций к антибиотикам. Так, ассоциация Proteus mirabilis + Escherichia coli была резистентна ко всем предложенным антимикробным средствам, кроме пефлоксацина, к нему микроорганизмы были условно-чувствительны.

Proteus mirabilis + Enterobacter cloacae чувствительны к гентамицину, пефлоксацину, к канамицину и цефуроксиму ассоциация была условночувствительна, резистентность была определена к доксициклину и тетрациклину, относящихся к группе тетрациклинов.

Таблица 2 – Результаты исследований чувствительности выделенных культур

Микроорганизмы	Антибиотики
	ГЕН	ДОК	КАН	ПЕФ	ТЕТ	ЦОМ
E. cloacae	Ч	У/Ч	Ч	Ч	Ч	Р
E. aerogenes	Ч	Ч	Ч	Ч	Ч	Ч
Hafnia spp.	Ч	Р	Ч	Ч	Ч	Ч
C. freundii	Ч/Ч	Р/Ч	У/Ч, Р	У/Ч	Ч/Р	Р
M. morganii	Ч	Ч	Р	Ч	Ч	Ч

Примечание: ГЕН – гентамицин, ДОК – доксициклин, КАН – канамицин, ПЕФ – пефлоксацин, ТЕТ – тетрациклин, ЦОМ – цефуроксим, Ч – чувствительны, У/Ч – умеренночувствительные, Р – резистентные

Изучая чувствительность к антибиотикам, выделенная ассоциация, состоящая из Proteus mirabilis + Morganella morganii, была чувствительна к гентамицину, канамицину и цефуроксиму, но при этом резистентна к доксициклину и тетрациклину, кроме этого, определили условную чувствительность к пефлоксацину.

Ассоциация Pseudomonas aeruginosa + Enterobacter cloacae проявили чувствительность только к гентамицину, к остальным антибиотикам определена резистентность.

Ассоциация Proteus vulgaris + Escherichia coli, состоящая из двух проб, одна из которых была резистентна ко всем антибиотикам, кроме канамицина и цефуроксима, проявляющая к ним условную чувствительность. Другая чувствительна к гентамицину и пефлоскацину, резистентность была проявлена к доксициклину, тетрациклину и цефуроксиму. Условная чувствительность проявлена к канамицину.

Заключение. За 2021 год у сельскохозяйственных животных было выделено 34 вида грамотрицательных бактерий, у непродуктивных животных – 26 видов, а у рептилий и приматов – 13 видов.

Среди грамотрицательных бактерий лидирующие позиции по наибольшему количеству выделенных культур занимает Escherichiacoli – 28,8 % (n=21), которую чаще всего выделяли от крупного рогатого скота (n=11). Второе место занимают сальмонеллы – 23,3 % (n=17), выделенные только от приматов (n=7), рептилий (n=6) и кроликов (n=4). Третье место по частоте выделения занимает Pseudomonas aeruginosa‒ 15 % (n=11), выделенная, в основном, от крупного рогатого скота (n=6).

В шести пробах из 68 были определены ассоциации из двух микроорганизмов. Чаще всего в составе ассоциаций присутствовали энтеробактерии рода Proteus (83,3 %) и Escherichia coli (50 %).

При определении чувствительности выделенных культур микроорганизмов к антимикробным препаратам были получены данные, что все грамнегативные бактерии различных родов обладали высокой чувствительностью к гентамицину. Что касается резистентности, то ее наблюдали чаще всего к доксициклину у Escherichia coli, Salmonella spp, Proteus, Hafnia spp, Citrobacter freundii. Также была отмечена резистентность у Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii к цефуроксиму. К канамицину был резистентен только вид Morganella morganii.

Резюме

Целью данного исследования является изучение антибиотикорезистентности культур микроорганизмов, выделенных от животных, к антимикробным препаратам. В данной статье представлены результаты исследования чувствительности культур, выделенных из клинического и патологического материалов животных, к различным антимикробным препаратам. При проведении бактериологических исследований 68 проб были выделены культуры микроорганизмов рода Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Proteus, Entorobacter, Hafnia, Citrobacter и Morganella. В результате исследований в видовом разнообразии микроорганизмов доминировал род Escherichia coli – 28,8 % (n=21), Salmonella spp. были выделены в 23,3 % (n=17) случаев. Резистентность микроорганизмов к антибактериальным препаратам определяли с помощью диско-диффузионного метода. Значительная часть культур грамотрицательных бактерий проявила резистентность к доксициклину из группы тетрациклинов. Также была отмечена резистентность культур к цефуроксиму и канамицину.