Антигенные свойства вируса африканской чумы свиней в искусственных и естественных смешанных популяциях

Гетерогенность вируса африканской чумы свиней (АЧС) выражается в различиях по физико-химическим, генетическим, вирулентным, гемадсорбирующим, антигенным свойствам (1). При анализе препаратов вируса АЧС в линейном градиенте концентрации сахарозы выявлена фракция с плавучей плотностью 1,20-1,21 г/см³ (плотность стандартного вируса АЧС — 1,17-1,18 г/см³), проявляющая интерферирующие свойства после инактивации ее инфекционности Y -облучением (2). Широко известна генетическая гетерогенность вируса АЧС (3). В результате филогенетического анализа по последовательности гена консервативного структурного белка р72 выявлено 22 генотипа изолятов вируса АЧС (4). В основу изучения гетерогенности популяции вируса АЧС по признаку гемадсорбции было положено доказательство генетической природы последнего. Об этом свидетельствовало постоянное соотношение числа клеток, фенотипически отражающих оба контрастных типа гемадсорбции («рыхлую» и «плотную»), при размножении вируса (5). Эти различия выражаются в форме его экспрессии на мембране таким образом, что визуально эритроциты располагаются либо в один слой, либо многослойно, и их число на одну гемадсорбирующую клетку варьирует от единиц до 80 и более. Площадь контакта эритроцита с мембраной, неодинаковая для разных вариантов вируса

АЧС, свидетельствовала о том, что наиболее прочно ассоциирован с клеткой гемадсорбирующий антиген у авирулентного аттенуированного штамма ФК-135, индуцирующего визуально однослойную («рыхлую») гемад-сорбцию. По данным иммунологических проб на свиньях и реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд), известные штаммы и изоляты разделены на 11 групп, из которых 8 охарактеризованы как сероиммуногруппы со своими референс-штаммами (6).

Цель настоящей работы заключалась в изучении антигенных свойств в экспериментально сформированных и природных смешанных популяций вируса африканской чумы свиней.

Методика. Исследования проводили на подсвинках (30-40 кг) породы крупная белая. Для изучения приготовили три искусственные смеси вирулентных изолятов вируса АЧС: 1 — II и IV сероиммунотипов (Кикас-са 74 + Бразилия 80); 2 — III и IV сероиммунотипов (Мозамбик 78 + Сан Томе и Принсипи); 3 — I и IV сероиммунотипов (Диаманг + Днопа-Луанда). Каждую смесь составляли близкие по инфекционности исходные изоляты, взятые в равных объемах. Опыты со смешанной инфекцией in vivo проводили в искусственно созданном микроэпизоотическом очаге. С этой целью полученными смесями в дозе 10⁶,⁵-10⁷,⁵ ГАЕ₅₀ внутримышечно заражали двух особей. Вместе с ними размещали четырех интактных подсвинков (1-й контактный пассаж). При ярко выраженных клинических признаках болезни у животных 1-го контактного пассажа к ним помещали следующую группу интактных подсвинков (2-й контактный пассаж). С каждой испытуемой смесью проводили 3-5 пассажей. Антигенные свойства изолятов и штаммов определяли в РЗГАд и на иммунизированных животных (иммунотиповая специфичность) (7). Для выявления АЧС тех сероиммунотипов, которые не обнаруживались в РЗГАд, вируссодержащим материалом (первая и вторая смеси), полученными от павших животных в 3-м контактном пассаже, внутримышечно заражали по два подсвинка, предварительно иммунизированных аттенуированным штаммом ФК-135 (IV сероим-мунотип) вируса АЧС.

В опытах in vitro для восстановления гемадсорбирующих свойств у потерявших способность к гемадсорбции изолятов, присутствующих в исходных смесях, использовали две схемы культивирования испытуемых проб крови от свиней 3-го контактного пассажа: пассирование в культуре клеток костного мозга свиньи (КМС) в присутствии специфической задерживающей гемадсорбцию сыворотки против того типа, который вызывал в смеси гемадсорбцию; использование перемежающихся пассажей в нечувствительной клеточной системе (7).

При изучении природной антигенной гетерогенности использовали изолят Киравира 67 (Танзания 67, Т-67). На основе выделенных из Т-67 вирулентных вариантов с разной сероиммунотиповой специфичностью получили аттенуированные варианты, которыми иммунизировали животных с последующим определением их устойчивость к исходному изоляту Т-67 (8).

Для концентрирования вирусных препаратов использовали полиэтиленгликоль (м.м. 6000 Да, «Serva», ФРГ).

За иммунизированными животными вели клиническое наблюдение с ежедневным измерением температуры тела. Накануне гибели отбирали пробы крови для сероиммунотипизации вируса, от павших животных — образцы тканей и органов и также проводили сероиммунотипизацию вирусов.

Результаты. При планировании экспериментов исходили из предположения, что смешанные вирусные популяции имеют селективные преимущества по сравнению с монотипными, поскольку они легче преодоле-65

вают барьер популяционного иммунитета у хозяина (9).

Наиболее важными свойствами вирусов и особенностями их экологической ниши, обеспечивающими возникновение смешанных популяций, представлялись следующие. Должны существовать изолированные локальные популяции вирусов и происходить изменения в среде обитания этих популяций (условия, которые требуются для дивергенции признака). Необходимо наличие путей заноса вирусов из одной локальной популяции в другую (переносчики, миграция хозяина, деятельность человека). Вирусы должны вызывать хотя бы у части зараженных хозяев нелетальную форму болезни с последующим длительным вирусоносительством. Изменения структуры протективного антигена, распознаваемого иммунной системой в качества маркера серотипа, не должны вызывать некомпенсируемые нарушения его функций. Антигенно различные варианты вирусов должны быть способны к длительному сосуществованию в организме хозяина, причем какой-либо из существующих вариантов может стать (и, как правило, обязательно становится) доминантным, но не приобретает способность окончательно вытеснить все остальные. Все необходимые и достаточные условия существования таких популяций вируса АЧС в природе имеются.

Экспериментальные смешанные популяции . Представлялось важным исследовать особенности функционирования экспериментальных смешанных популяций вируса АЧС, которые можно рассматривать как модель для сходных популяций, формируемых в природных условиях естественным образом.

При серотипировании вируса АЧС, выделенного из крови павших подсвинков, было установлено доминирование в смесях одних изолятов над другими. На примере первой смеси (Кикасса-74 + Бразилия 80, соответственно II и IV сероиммунотип) показали, что доминирование вируса АЧС IV серотипа наблюдается уже у внутримышечно зараженных животных. По результатам РЗГАд у одного из двух павших подсвинков этой группы выявляли вирус IV серотипа, у другого — смесь двух серотипов. При 1-м контактном пассаже у одного из четырех подсвинков обнаружили вирус IV серотипа, у остальных — смесь двух исходных серотипов вируса. Однако предельные разведения крови (10-8-10-9), по данным РЗГАд, содержали вирус АЧС только IV серотипа. Из крови и органов павших животных 2-го и 3-го контактных пассажей в РЗГАд выявляли вирус АЧС только IV серотипа.

У особей, контактно инфицированных в экспериментальных микроэпизоотиях, необходимо было установить наличие в пробах крови вируса АЧС тех исходных сероиммунотипов, которые не выявлялись в РЗГАд. Подсвинки, внутримышечно инфицированные с этой целью (после предварительной иммунизации вирусом АЧС штамм ФК-135) материалом (первая и вторая смесь) от павших животных 3-х контактных пассажей, погибали на 5-7-е сут с признаками острой формы болезни. В эти же сроки погибали и контрольные животные, которые до заражения были интактными. Выделенный от павших животных вирус (как и исходный материал) на основании РЗГАд относился к IV серотипу. Полученные данные указывали на несоответствие результатов типизации на основании иммунологической пробы на иммунизированных животных и в РЗГАд.

Подобный факт, по-видимому, объясняется присутствием в исследуемых биологических материалах вариантов вируса АЧС других сероиммунотипов, имеющихся в исходных смесях, которые в процессе смешанного инфицирования животных утратили гемадсорбирующие свойства. Внутримышечное заражение такими материалами интактных или иммун-66

ных к IV сероиммунотипу животных в течение трех пассажей не привело к восстановлению гемадсорбции у вируса АЧС одного из двух исходных изолятов. В то же время, по данным РЗГАд, культивирование трех изучаемых смесей вируса АЧС в клетках КМС в течение 7-10 пассажей не вызывало утрату способности индуцировать гемадсорбцию у исходных штаммов. Следует отметить, что гибель иммунных к IV сероиммунотипу животных происходила как при заражении цельными пробами крови, так и при использовании их предельных разведений. Это косвенно указывало на наличие в испытуемой смеси исходных изолятов вируса АЧС в близких количествах. Аналогичные результаты были получены с третьей смесью, где по гемадсорбции доминировал вирус АЧС I серотипа.

Восстановление гемадсорбирующих свойств in vitro. Восстановление гемадсорбирующих свойств у утративших их изолятов, присутствующих в исходных смесях, проводили для первой и второй смеси вируса АЧС. При использовании первой схемы принципиально показана возможность перевода негемадсорбирующих изолятов, присутствующих в смесях, в гемадсорбирующую форму. Так, в одном из шести образцов в варианте со второй смесью на 7-м пассаже в культуре клеток КМС в присутствии специфической сыворотки IV серотипа выделяли гемадсор-бирующий вирус III серотипа. Применение второй схемы в течение 8 пассажей не дало положительных результатов.

Природные смешанные изоляты . Наиболее интересным с точки зрения антигенной гетерогенности оказался изолят Киравира 67 (Танзания 67, или Т-67). При его пассировании в различных культуральных системах и/или контактными пассажами на иммунных животных были получены 2 группы вариантов: первая — соответствующие I (референсштамм Лиссабон 57) и III (референс-штамм Мозамбик 78) сероиммуноти-пам, вторая — отличающиеся как друг от друга, так и от всех доступных на период проведения эксперимента природных изолятов вируса АЧС, которые были отнесены к двум новым (V и VI) сероиммунотипам (10-12).

Для окончательного доказательства антигенной гетерогенности изо-лята Т-67 получили аттенуированные варианты из четырех выделенных из него и различающихся по сероиммунотиповой специфичности вирулентных вариантов, которыми иммунизировали животных и затем определяли их устойчивость к исходному изоляту Т-67. Три особи из пяти были иммунизированы аттенуированным штаммом МК-200 (Мозамбик культуральный 200) III сероиммунотипа (1-я группа), две — аттенуированным вариантом вируса АЧС V сероиммунотипа (2-я группа). Эти животные оставались клинически здоровыми в течение 30-45 сут после контрольного заражения гомологичным вирулентным вариантом, выделенным из изоля-та Т-67 вируса АЧС. Затем животных иммунизировали концентрированными вирусными препаратами выделенных из изолята Т-67 вариантов ТС 18/22 (I сероиммунотип), ТКФ или ТПС-10 (III сероиммунотип), ТСП-278 (V сероиммунотип), Тс-7/220 (VI сероиммунотип) в дозах 108,5-109,0 ГАЕ50. Иммунизацию проводили с максимальными интервалами 15 сут (в зависимости от клинической реакции на очередное введение вируса). В 1-й группе использовали варианты V, VI и I сероиммунотипов, во 2-й группе — III, VI и I сероиммунотипов. На 7-е сут после последней иммунизации подсвинкам вводили смесь вирусов всех четырех сероиммунотипов (по 103-104 ГАЕ50 каждого), при этом использовали менее аттенуированные и более ре-актогенные варианты от ранних пассажей. Контрольное заражение иммунизированных животных проводили на 21-е сут после окончания иммунизации, вводя внутримышечно изолят Т-67 (лиофилизированная вирус- кровь) в дозе 103-105 ГАЕ50. В ответ на введение смеси вариантов вируса АЧС у животных наблюдали реакцию в виде 1-3-суточного повышения температуры тела до 40,6-41,0 °С и некоторого угнетения, и к моменту контрольного заражения изолятом Т-67 все они были клинически здоровы. После заражения изолятом Т-67 наблюдали заболевание и гибель только одного подсвинка, тогда как у четырех остальных в течение всего срока наблюдения (25 сут) никаких признаков заболевания АЧС не отмечали.

Таким образом, последовательная иммунизация аттенуированными вариантами вируса АЧС, полученными от выделенных из изолята Т-67 четырех вирулентных вариантов, отличающихся по сероиммунотиповой специфичности, индуцировала у четырех из пяти иммунизированных животных формирование защиты к заражению исходным изолятом, что полностью подтвердило предположение о сероиммунотиповой гетерогенности изолята Т-67. Полученные результаты подтверждают наличие и циркуляцию в природе вируса АЧС в виде гетерогенной в сероиммунотиповом отношении популяции. Кроме того, проведенные исследования показали принципиальную возможность создания защиты к изоляту Т-67 при иммунизации животных аттенуированными вариантами выделенных из него вирулентных вариантов четырех сероиммунотипов.

Есть также все основания считать, что штаммы Испания 70 и Португалия 60, вызвавшие эпизоотии среди домашних свиней в Европе, гете-рогенны. По результатам РЗГАд они отнесены к IV серотипу, но при постановке иммунологической пробы устойчивые к IV сероиммунотипу животные погибали от каждого из этих штаммов в отдельности (8).

Итак, при инфицировании животных смесью изолятов вируса африканской чумы свиней (АЧС) с различной сероиммунотиповой специфичностью наблюдается стойкое доминирование одних изолятов над другими по гемадсорбции. Результаты типизации вируса АЧС из проб крови свиней после контактного заражения искусственно сформированными смесями изолятов, неоднозначны: данные, полученные в иммунологической пробе, не соответствуют регистрируемым при реакции задержки гемадсорбции. У присутствующих в смесях негемадсорбирующих вариантов вируса АЧС гемад-сорбция не восстанавливается после обычного пассирования в культуре клеток костного мозга свиней или через организм животного, и для идентификации таких многокомпонентных изолятов требуется разработка специальных методов. Проведенные исследования свидетельствуют о существовании природных изолятов со смешанным сероиммунотипом, что, в частности, необходимо учитывать при описании иммунобиологических свойств новых изолятов вируса АЧС и разработке специфических средств защиты.