Ассоциации полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 с остеопорозом в зависимости от длительности постменопаузы

Введение. Остеопороз относится к широко распространенным заболеваниям человека и в структуре заболеваемости занимает одно из ведущих мест наряду с болезнями сердечно-сосудистой системы, злокачественными опухолями и травмами [1]. Среди известных видов заболевания наибольшую медицинскую и социально-экономическую значимость имеет постменопаузальный остеопороз. Постменопаузальный остеопороз в России, как и в других регионах мира, представляет одну из важнейших проблем здравоохранения. Подтверждением этому являются данные, свидетельствующие о том, что в России остеопороз выявляется у каждой третьей женщины старше 50 лет [2]. Следствием остеопороза являются низкоэнергетические переломы, среди которых вертебральные ком- прессионные переломы составляют около 50 % [1]. В силу указанных обстоятельств основными задачами системы здравоохранения должны стать ранняя диагностика остеопороза на этапе отсутствия осложнений и назначение патогенетической терапии пациентам с высоким риском переломов [1, 2].

Остеопороз является мультифакторным заболеванием, а доля генетической составляющей в его этиопатогенезе достигает 60-80 % [3, 4]. Поэтому одним из путей реализации программы борьбы с остеопорозом является поиск генетических предикторов заболевания, разработка и внедрение в медицинскую практику критериев выявления женщин с высоким риском развития патологии. Одним из генов-кандидатов остеопороза является ген TNFSF11, кодирующий белок

RANKL. Молекулы RANKL – важный компонент системы RANKL-RANK-OPG-сиг-нализации, которая играет ключевую роль в обеспечении баланса между образованием и резорбцией костной ткани [5]. Выявлено несколько мутаций гена TNFSF11, одной из которых является полиморфизм rs9594738 (C>T). К настоящему времени выполнен ряд исследований, направленных на изучение роли данного полиморфизма в формировании остеопороза и возникновении переломов [6–9]. Однако полученные результаты имеют определенные противоречия. Одной из причин данных противоречий могут быть возрастные особенности обследованных лиц, в т.ч. несоответствие в различных работах групп женщин по длительности постменопаузального периода. Необходимо отметить, что влияние сроков после наступления менопаузы на ассоциации полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 с остеопорозом не изучалось.

Цель исследования. Изучить ассоциации генотипов и аллелей полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 с остеопенией и остеопорозом на уровне поясничных позвонков L1–L4 у женщин в зависимости от длительности постменопаузы.

Материалы и методы. При выполнении работы было обследовано 483 женщины в постменопаузальный период. Возраст женщин определялся в пределах от 38 до 87 лет (61,0±0,5 года), а длительность постменопаузы – от 1 до 40 лет (12,00±0,49 года). Критериями исключения при отборе женщин на обследование являлись получение заместительной гормональной и антиостеопоротиче-ской терапии, применение глюкокортикостероидных препаратов. Также исключались пациенты с наличием овариоэктомии, эндокринных и метаболических расстройств, гематологических заболеваний, неопластических состояний, хронических заболеваний почек и печени, аутоиммунной патологии, системных заболеваний соединительной ткани, хронических воспалительных заболеваний.

Денситометрия костной ткани в зоне поясничных позвонков L1–L4 выполнялась методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии. Для этого использовались денситометры Discovery W QDR Series X-Ray Bone Densitometer (HOLOGIC Inc., США) и Prodigy (GE Medical Systems LUNAR, США). Диагноз устанавливался на основании значений Т-критерия. Его показатели до -1,0 стандартного отклонения от пиковой костной массы считались нормальными. Более низкие значения Т-критерия соответствовали остеопении (от -2,5 до -1,0 стандартного отклонения) и остеопорозу (-2,5 стандартного отклонения и ниже).

Выделение ДНК из лейкоцитов крови и детекция полиморфизма rs9594738 гена TNFSF11 осуществлялись с помощью соответствующих наборов производства «ДНК-Технология» (Москва, РФ) методом ПЦР в режиме реального времени. Учет реакции производился на амплификаторе детектирующем ДТ-96 («ДНК-Технология», Москва, РФ).

Статистическая обработка полученных данных выполнялась при помощи программ MedStat и STATISTICA for Windows 6.0 (StatSoft, Inc.). Достоверность различий в распределении генотипов и аллелей между группами оценивалась при помощи χ2 (таблицы сопряженности kXm) и методом углового преобразования Фишера с учетом поправки Йейтса. Соответствие распределения данных закону Hardy–Weinberg [10] оценивалось с помощью критерия χ2. Степень ассоциации генотипа и аллелей с остеопенией и остеопорозом рассчитывалась по величине отношения шансов (OR) с учетом 95 % доверительного интервала (95 % CI). Отличия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты. Изучение ассоциаций полиморфизма rs9594738 гена TNFSF11 с развитием остеопороза и остеопении выполнялось как в общей группе женщин, так и в выделенных подгруппах лиц с различной длительностью постменопаузы (до 6 лет, 6–10 лет, 11–15 лет, более 15 лет). Необходимо отметить, что распределение генотипов вышеуказанного полиморфизма как в общей группе, так и среди женщин всех подгрупп соответствовало закону Hardy–Weinberg (табл. 1). Причем удельный вес обладателей генотипов СС (от 23,5 до 41,8 %), СТ (от 43,6 до 54,2 %) и ТТ (от 14,6 до 27,0 %) между подгруппами существенно не изменялся (p>0,05).

Таблица 1

Соответствие закону Hardy–Weinberg распределения генотипов полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11

у обследованных женщин c различной длительностью постменопаузы

Генотипы полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11	Установленные частоты генотипов		Ожидаемые частоты генотипов		p
	абс.	%	абс.	%
В общей группе женщин в постменопаузу (n=483)
СС	139	28,8	138,9	28,8	0,983
СT	240	49,7	240,2	49,7
TT	104	21,5	103,9	21,5
В подгруппе женщин с длительностью постменопаузы до 6 лет (n=107)
СС	27	25,2	28,3	26,4	0,623
СT	56	52,3	53,4	50,0
TT	24	22,5	25,3	23,6
В подгруппе женщин с длительностью постменопаузы 6–10 лет (n=110)
СС	46	41,8	44,6	40,5	0,549
СT	48	43,6	50,9	46,3
TT	16	14,6	14,5	13,2
В подгруппе женщин с длительностью постменопаузы 11–15 лет (n=100)
СС	27	27,0	25,0	25,0	0,424
СT	46	46,0	50,0	50,0
TT	27	27,0	25,0	25,0
В подгруппе женщин с длительностью постменопаузы более 15 лет (n=166)
СС	39	23,5	42,5	25,6	0,276
СT	90	54,2	83,0	50,0
TT	37	22,3	40,5	24,4

Анализ распределения генетических маркеров в общей группе женщин показал наличие достоверных различий в частотах обнаружения генотипов (p=0,003) и аллелей (p<0,001) полиморфизма rs9594738 гена TNFSF11 между здоровыми женщинами, пациентами с остеопорозом и остеопенией поясничных позвонков L1–L4 (табл. 2). Выявленные различия были обусловлены генетическими особенностями женщин, имеющих остеопороз. Так, среди лиц с остеопорозом поясничных позвонков отмечено существенное снижение носителей генотипа СС по сравнению со здоровыми женщинами (OR=0,40; 95 % CI (0,23–0,69); p=0,001) и увеличение числа обладателей генотипа ТТ по сравнению как с пациентами, имеющими остеопению (OR=1,78; 95 % CI (1,05–3,02); p=0,048), так и с обследуемыми контрольной группы (OR=2,36; 95 % CI (1,37–4,06); p=0,003). Изучение частот аллелей показало, что при остеопорозе реже выявлялся аллель

С и чаще – аллель Т, чем при остеопении (OR=0,66; 95 % CI (0,47–0,91); p=0,015 и OR=1,52; 95 % CI (1,10–2,11); p=0,015 соот- ветственно) и у здоровых женщин (OR=0,52; 95 % CI (0,37–0,72); p<0,001 и OR=1,94; 95 % CI (1,40–2,68); p<0,001 соответственно).

Таблица 2

Частота генотипов и аллелей полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 в постменопаузальный период у здоровых женщин и у женщин с остеопенией и остеопорозом на уровне поясничных позвонков L1–L4

Генотипы и аллели	Частота генотипов и аллелей полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 среди женщин						p
	с остеопорозом		с остеопенией		здоровых
	абс.	%	абс.	%	абс.	%
СС	23	18,4	49	28,5	67	36,0	0,003
СТ	63	50,4	88	51,2	89	47,9
ТТ	39	31,2	35	20,3	30	16,1
С	109	43,6	186	54,1	223	59,9	<0,001
Т	141	56,4	158	45,9	149	40,1

На следующем этапе статистической обработки полученных данных был произведен анализ связей полиморфных вариантов гена TNFSF11 с остеопоротическими изменениями поясничных позвонков L1–L4 в зависимости от длительности у обследованных женщин постменопаузального периода. В результате было установлено, что в группах женщин, имеющих срок после последней менструации до 6 лет и более 15 лет, частота регистрации генотипов и аллелей полиморфизма rs9594738 гена TNFSF11 не имела ассоциаций (p>0,05) с остеопоротическими изменениями поясничных позвонков (табл. 3, 4). Различия в распределении генетических маркеров между здоровыми женщинами и пациентами с остеопорозом и остеопенией были выявлены (p<0,05) только в подгруппах лиц с длительностью постменопаузы 6–10 и 11– 15 лет. Причем эти ассоциации были обусловлены, как и в общей группе, особенностями генетического профиля пациентов с остеопорозом. Так, женщины с остеопорозом, которые были обследованы спустя 6–10 лет после последней менструации, по сравнению с контрольной группой имели более редкую регистрацию генотипа СС (OR=0,19; 95 % CI (0,06–0,57); p=0,005) и аллеля

С (OR=0,30; 95 % CI (0,15–0,61); p=0,002) при повышенной встречаемости аллеля Т (OR=3,13; 95 % CI (1,63–6,74); p=0,002). Аналогичные связи были характерны и для женщин с длительностью постменопаузы 11–15 лет. Как и в предыдущей группе, генетическим фактором риска развития остеопороза явилось наличие аллеля Т (OR=3,16; 95 % CI (1,53–6,51); p=0,003), а защитным – генотипа СС (OR=0,19; 95 % CI (0,06–0,60); p=0,009) и аллеля С    (OR=0,32;

95 % CI (0,15–0,65); p=0,003). Причем в обеих группах женщин (с длительностью постменопаузы 6–10 и 11–15 лет) частота обнаружения генотипа ТТ имела близкую к статистической значимости тенденцию к увеличению при остеопорозе (р=0,086 и р=0,081 соответственно).

Таблица 3

Частота генотипов и аллелей полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 у здоровых женщин и у женщин с остеопенией и остеопорозом на уровне поясничных позвонков L1–L4 с длительностью постменопаузы до 6 лет и 6–10 лет

Генотипы и аллели	Частота генотипов и аллелей полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 среди женщин						p
	с остеопорозом		с остеопенией		здоровых
	абс.	%	абс.	%	абс.	%
с длительностью постменопаузы до 6 лет (n=107)
СС	4	23,5	10	26,3	13	25,0	0,980
СТ	10	58,8	19	50,0	27	51,9
ТТ	3	17,7	9	23,7	12	23,1
С	18	52,9	39	51,3	53	51,0	0,980
Т	16	47,1	37	48,7	51	49,0
с длительностью постменопаузы 6–10 лет (n=110)
СС	5	19,2	14	38,9	27	56,3	0,025
СТ	14	53,9	17	47,2	17	35,4
ТТ	7	26,9	5	13,9	4	8,3
С	24	46,2	45	62,5	71	74,0	0,003
Т	28	53,8	27	37,5	25	26,0

Таблица 4

Частота генотипов и аллелей полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 у здоровых женщин и у женщин с остеопенией и остеопорозом на уровне поясничных позвонков L1–L4 с длительностью постменопаузы 11–15 лет и более 15 лет

Генотипы и аллели	Частота генотипов и аллелей полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 среди женщин						p
	с остеопорозом		с остеопенией		здоровых
	абс.	%	абс.	%	абс.	%
с длительностью постменопаузы 11–15 лет (n=100)
СС	6	15,0	8	24,2	13	48,2	0,031
СТ	19	47,5	17	51,6	10	37,0
ТТ	15	37,5	8	24,2	4	14,8
С	31	38,8	33	50,0	36	66,7	0,007
Т	49	61,2	33	50,0	18	33,3
с длительностью постменопаузы более 15 лет (n=166)
СС	8	19,1	17	26,2	14	23,7	0,357
СТ	20	47,6	35	53,8	35	59,3
ТТ	14	33,3	13	20,0	10	17,0
С	36	42,9	69	53,1	63	53,4	0,259
Т	48	57,1	61	46,9	55	46,6

Обсуждение. В структуре заболеваемости по показателям социально-экономической и медицинской значимости остеопороз является ведущей патологией костно-мышечной системы. Причем подавляющее большинство случаев заболевания и связанных с ними низкоэнергетических переломов приходится на женщин в постменопаузальный период. В решении проблемы постменопаузального остеопороза важное место отводится предупреждению и ранней диагностике заболевания [1, 2], а в достижении вышеуказанных целей приобретают научную и практическую значимость молекулярно-генетические методы исследования [11].

Одним из известных к настоящему времени генов-кандидатов остеопороза является ген TNFSF11. Выполненный нами анализ результатов, полученных в общей группе обследованных женщин (n=483), показал, что генетическими предикторами постменопаузального остеопороза являются генотип ТТ и аллель Т полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11, а защитным эффектом обладают генотип СС и аллель С. Эти данные согласуются с выводами, сделанными рядом других исследователей, которые также обнаружили аналогичные ассоциации и подтвердили роль вышеуказанного полиморфизма в формировании остеопороза поясничных позвонков [6, 7]. В других же работах влияния полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 на минеральную плотность костной ткани обнаружено не было [9].

Причинами данных противоречий могут быть недостаточное количество наблюдений в отдельных работах, различия характеристик обследованных лиц: расовые, возрастные, по условиям географического проживания, уровню потребления витамина D и кальция и т.д. Несоответствие результатов может быть обусловлено и влиянием такого фактора, как длительность постменопаузы. Известно, что с увеличением срока после наступления менопаузы повышается риск развития остеопороза [12]. Поэтому длительность постменопаузы может влиять на фенотипические проявления генетической предрасположенности, усиливая или, наоборот, ослабляя эффекты полиморфизмов того или иного гена-кандидата постменопаузального остеопороза. Это нашло подтверждение и в нашей работе. Несмотря на выявленные ассоциации генотипов и аллелей полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 в общей группе женщин, не были обнаружены связи вышеуказанного полиморфизма с формированием остеопороза поясничных позвонков L1–L4 у женщин в течение первых 5 лет после последней менструации и спустя 16 лет и более. Возможно, что ранние сроки постменопаузы являются еще недостаточными для реализации влияния полиморфных вариантов гена TNFSF11 на состояние костной ткани, а уже в поздние сроки роль изученной мутации может быть нивелирована другими генетическими или внешними факторами. Поэтому при использовании полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 в качестве прогностического маркера развития постменопаузального остеопороза необходимо результаты генетического тестирования оценивать дифференцированно в зависимости от длительности постменопаузального периода.

Заключение. Таким образом, в общей группе обследованных наличие у женщин генотипа ТТ и аллеля Т полиморфизма rs9594738 (C>T) гена TNFSF11 сочетается с повышенным риском развития постменопаузального остеопороза поясничных позвонков L1–L4, а генотип СС и аллель С обладают защитным эффектом (p<0,05). При этом ассоциаций полиморфных вариантов вышеуказанного гена TNFSF11 с остеопоротическими изменениями не установлено (p>0,05) в подгруппах женщин с длительностью постменопаузы менее 6 лет и более 15 лет. Полученные данные целесообразно использовать при разработке критериев для выявления предрасположенности к постменопаузальному остеопорозу и повышения эффективности лечебно-профилактических мероприятий.