Ассоциация полиморфизма Ala16Val гена супероксиддисмутазы 2 (SOD2) с ишемической болезнью сердца у мужчин в российской популяции

ИБС – распространенное мультифакторное заболевание, которое является одной из ведущих причин смертности в различных странах [11]. Наиболее частой причиной ИБС служит атеросклероз коронарных сосудов. Одним из механизмов, лежащих в основе развития атеросклероза, является окислительный стресс, представляющий собой повышение уровня активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, перекиси водорода, гидроксильного радикала) вследствие нарушения в организме баланса между прооксидантной и антиоксидантной системами [1]. Активные формы кислорода участвуют в окислении липопротеинов низкой плотности [3], нарушение которого рассматривается как фундаментальный шаг в инициации и прогрессировании коронарного атеросклероза [12].

Одним из важнейших ферментов антиоксидантной системы является супероксиддисмутаза-2, осуществляющая превращение супероксид-аниона в кислород (О2) и перекись водорода (Н2О2). Последняя, в свою очередь, детоксицируется глутатионпероксидазой и каталазой до воды [15].

Значимость супероксиддисмутазы-2 в обменных процессах подтверждена в экспериментальных исследованиях на мышах, которых нокаутировали по гену SOD2 (SOD2–/–). В результате эти животные умирали в течение первых 10 дней жизни с явлениями дилатационной кардиомиопатии, массивным накоплением жира в печени и скелетной мускулатуре и метаболическим ацидозом [8]. У таких мышей выявлено нарушение работы дыхательной цепи митохондрий, резкое снижение активности сукцинатдегидрогеназы и аконитазы в сердце [8] и развитие острой сердечной недостаточности [6]. У мышей с гетерозиготной делецией (SOD2+/–) активность супероксид-дисмутазы снижалась во всех тканях на 50%. При этом наблюдался повышенный уровень окислительных повреждений ядерной ДНК и чаще встречались онкологические заболевания. Однако продолжительность жизни мышей не сокращалась, и развивались они нормально. Таким образом, уменьшение активности SOD2 приводило к повышенному уровню окислительных повреждений ядерной ДНК и увеличению риска развития рака, но не влияло на продолжительность жизни [14].

В клетке супероксиддисмутаза-2 локализована в митохондриальном матриксе. Ген SOD2, кодирующий данный фермент, расположен на хромосоме 6q25.3 и состоит из 5 экзонов [7]. Установлено, что на работу суперок-сиддисмутазы-2 оказывает влияние полиморфизм Ala16Val (С/Т), rs4880 гена SOD2. В ряде работ сообщается о влиянии последнего на развитие сердечно-сосудистых заболеваний. Так, у больных диабетом I типа генотипы TT и CT рассматриваются как предикторы повышенного риска сердечно-сосудистых заболеваний независимо от пола, возраста, курения, артериального давления, уровня холестерина [9].

Цель работы: анализ ассоциаций полиморфизма Ala16Val гена SOD2 с ИБС у мужчин.

Материал и методы

Для проведения исследования были сформированы две группы мужчин: основная – больные ИБС и контрольная. В исследуемые группы включались лица, нерод- ственные между собой.

Основную группу составили 155 человек, средний возраст – 55±8 лет. Критерием включения служило наличие у пациента такой формы ИБС как перенесенный инфаркт миокарда в анамнезе.

В качестве контрольной группы выступали представители случайной поквартирной выборки мужчин Ленинского района г. Томска. Выборка формировалась на основе списка квартир жилищно-эксплуатационных управлений района с использованием таблицы случайных чисел. Всего было обследовано 630 мужчин в возрасте 20–59 лет, отклик на исследование составил 71%. В контрольную группу были включены 129 представителей популяционной выборки аналогичного возраста с мужчинами основной группы. Средний возраст представителей контрольной группы составил 54±8 лет. Из контрольной группы лица с ИБС специально не исключались.

Материалом для исследования служила геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов венозной крови методом фенол-хлороформной экстракции. Полиморфизм Ala16Val изучали с помощью рестрикционного анализа. Праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР) подбирали с использованием программы Primer3. (F 5'-CCAGCAGGCAGCTGGCACCG -3' и R 5'-CAACGCCTCCTGGTACTTCT-3'). Параметры температурных циклов ПЦР были следующие: начальная денатурация – при 95 °С, 4 мин, 30 циклов амплификации по схеме: денатурация – при 95 °С, 30 с, отжиг праймеров – при 64 °С, 30 с, элонгация – при 72 °С, 30 с, после чего пробы инкубировали 5 мин при 72 °С. Смесь для ПЦР содержала по 5 пМоль прямого и обратного праймеров, буфер для Taq-полимеразы производства “СибЭнзим”, Новосибирск (1,5 мМ MgCl2 в реакционной смеси), 1 единицу активности Taq-полимеразы производства “Биосан”, Новосибирск, по 2 нмоль каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, около 100 нг геномной ДНК. Для рестрикции использовали фермент BshTІ (1 е.а.) производства “Fermentas”, Латвия. Продукты рестрикции фракционировали 30 мин в 3%-м агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием и регистрировали результаты с помощью гель-документирующей системы.

Обработку полученных данных осуществляли с помощью программы “MS Excel”, статистического пакета

Таблица 1

Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфизму Ala16Val гена SOD2

SOD2(Ala16Val)	Относительные частоты генотипов, %			Относительные частоты аллелей, %
	CC	CT	TT	C	T
Контроль мужчины (n=129)	29,69	52,34	17,97	55,86	44,14
Больные ИБС мужчины (n=155)	17,42	55,48	27,10	45,16	54,84

Таблица 2

Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма Ala16Val гена SOD2

Сравниваемые выборки	Генотипы	Аллели
Контроль мужчины (n=129) Больные ИБС мужчины (n=155)	χ2=7,265 p=0,026 OR=1,70	χ2=5,998 p=0,014 OR=1,54

Примечание: χ2 – значение критерия, p – уровень значимости, OR – отношение шансов.

STATISTICA 6.0. Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга использовали критерий χ ²Пирсона. Для попарного сравнения частот генотипов и аллелей между анализируемыми группами использовали критерий χ ² Пирсона с поправкой Йейтса. Отношение шансов для отдельных генотипов и аллелей и доверительный интервал рассчитывали согласно J.M. Bland and D.G. Altman [2]. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

В ходе исследования проанализировано распределение генотипов и аллелей полиморфного варианта Ala16Val гена SOD2 в исследуемых выборках (табл. 1).

Данные сравнительного анализа частот генотипов и аллелей полиморфизма Ala16Val гена SOD2 представлены в таблице 2.

В результате исследования выявлены статистически значимые различия в распределении частот генотипов и аллелей исследованных выборок. Частота аллеля Т у мужчин контрольной группы составила 44,14%, а у больных ИБС мужчин 54,84% ( χ ²=5,998; p=0,014; OR=1,54). Частота генотипа ТТ в группе больных ИБС мужчин составила – 27,10% что также статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой – 17,97 ( χ ²=7,265; p=0,026; OR=1,70). Таким образом, выявленные статистически значимые различия по частотам аллелей и генотипов между контрольной выборкой и выборкой больных ИБС за счет преобладания аллеля Т и генотипа ТТ в группе больных ИБС говорят о том, что аллель Т и генотип ТТ ассоциирован с ИБС у мужчин .

Известно, что активность фермента, содержащего валин (аллель Т) на 23% ниже, чем содержащего Ala (аллель C), а следовательно, у носителей генотипов СС и СТ супе-роксиддисмутаза-2 обладает большей активностью, чем у носителей генотипа ТТ. Полиморфизм Ala16Val, приводящий к замене аланина на валин, локализован в участке, отвечающем за связывание с митохондрией для транспортировки фермента в митохондриальный матрикс. В митохондриальном матриксе этот участок расщепляется, и фермент переходит в активную форму [10]. Отмечено, что фермент, содержащий в этой позиции валин Val(Т), транспортируется в митохондриальный матрикс медленнее, чем белок с Ala(C) [13]. Соответственно, у них меньше накапливается супероксид в матриксе, что приводит к меньшей степени супероксид-индуцированных повреждений [13]. В клинических исследованиях установлено, что у женщин с диабетом генотип ТТ ассоциирован с ИБС, а у мужчин такой ассоциации не наблюдается. Возможно, эффект генотипа ТТ у мужчин не выявлен из-за того, что традиционные факторы риска у мужчин играют более важную роль, чем у женщин [5]. Также показано, что аллель Т rs4880 ассоциирован с атеросклерозом и гипертензией [4].

Заключение

Таким образом, в настоящем исследовании показано, что аллель Т, соответствующий аминокислоте валину полиморфизма Ala16Val гена SOD2, и генотип ТТ ассоции- рованы с повышенным риском развития ИБС у мужчин в российской популяции. Полученные данные могут быть использованы при разработке диагностических панелей генетических маркеров предрасположенности к ИБС.

Исследование выполнено при поддержке Федеральной целевой программы “Научные и научно-педагогические кадры для инновационной России” ГК № П722 от 12.08.2009, П977 от 20.08.2009.