Ассоциация полиморфизмов HSPA1B, S100B и TNF- генов с риском развития хронической ртутной интоксикации

Ранее сообщалось, что медицинское сопровождение предприятий производства каустика с технологией ртутного электролиза позволило сформировать когорту работников, хронически экспонированных парами металлической ртути [1]. Последняя включала в том числе пациентов в отдаленном периоде хронической ртутной интоксикации (ХРИ) с прогредиентным характером течения и формированием тяжелого органического поражения головного мозга [2]. Обнаруженные у пациентов этой группы признаки нейродегенеративных процессов определили наш интерес к белкам теплового шока семейства 70 (HSP70, HSPA1 гены), играющим ключевую цитопротекторную роль при нейродегенеративных заболеваниях [3]. Было установлено, что носительство СС-HSPA1A (+190G/C) и GG-HSPA1B (+1267A/G) редких гомозигот и их комбинации ассоциировано с высоким риском развития ХРИ [1]. Кроме того, носители GG-HSPA1B (+1267A/G) генотипа имели больший биологический возраст относительно такового у носителей других генотипов среди пациентов с диагнозом ХРИ [4].

Специфика поражения головного мозга у пациентов с ХРИ обусловила наше внимание к фактору некроза опухолей TNF-α как к ключевому медиатору воспалительного / иммунного ответа [5]. Ген TNF-α является одним из самых полиморфных генов цитокинов и, как и HSPA1 -гены, располагается в

Черняк Юрий Ильич – доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: ; тел.: 8 (3955) 58-69-10, доб. 1412; ORCID: .

локусе главного комплекса гистосовместимости на коротком плече хромосомы 6. Giacconi et al. [6] установили значимую связь между 1267A/G HSP70 -полиморфизмом и уровнями TNF-α в плазме у здоровых пожилых людей. В частности, носители G-аллеля имели повышенный уровень TNF-α, что, по мнению авторов, свидетельствует о провоспалительной роли этого аллеля. Выраженная экспрессия HSP70 вызывает репрессию индуцированной липополисахаридами продукции TNF-α и IL-6, оказывая противовоспалительный эффект.

В сыворотке крови пациентов с диагнозом ХРИ было отмечено значимое повышение концентрации эндогенного белка S100В, принадлежащего к суперсемейству кальцийсвязывающих белков S100, что могло характеризовать степень активности патологического процесса [7]. Белок S100B экспрессируется в различных типах клеток центральной нервной системы, его повышенные концентрации были описаны, в частности, для пациентов с болезнью Альцгеймера и Паркинсона [8, 9]. Из-за отсутствия специфичности некоторые исследователи не рекомендуют полагаться на концентрацию белка для дифференциальной диагностики в случае подозрения на нейродегенеративные расстройства, а также отмечают ограниченную полезность S100B для мониторинга прогрессирования заболевания [10]. К настоящему времени в литературе достаточно широко представлены результаты исследований, направленных на оценку возможной связи между однонуклеотидными полиморфизмами в гене, кодирующем S100B, и различными заболеваниями [9, 11, 12].

Цель настоящей работы – исследование ассоциации некоторых полиморфизмов HSPA1B , S100B и TNF-α генов с риском формирования хронической ртутной интоксикацией.

Материалы и методы. Для выявления ассоциации полиморфных вариантов HSPA1B (+1267A/G, rs1061581), TNF-α (–308G/A, rs1800629) и S100B (C/T, rs9722) генов с формированием ХРИ была изучена сформированная в 2016 г. и позднее дополненная когорта из 128 бывших работников производства каустика, подвергшихся хроническому воздействию паров ртути [1]. Обследованных распределили в две группы: стажированные работники, не имеющие ХРИ, составили группу 1 ( n = 46), пациенты в отдаленном периоде ХРИ – группу 2 ( n = 82). Для оценки распределения носительства генотипов HSPA1B (+1267A/G) полиморфного локуса в региональной субпопуляции дополнительно были обследованы 298 мужчин (группа 3) из практически здоровых работников, не контактировавших с ртутью в производственных условиях. Данные о результатах многолетних клинических обследований персонала, о содержании ртути в биосубстратах и загрязнении рабочей зоны предприятий производств каустика были обобщены ранее [1].

После получения письменного информированного согласия на участие в обследовании выполнял- ся забор венозной крови в вакутейнеры с K3ЭДТА. Образцы аликвотировали и хранили при температуре –70 °С до проведения анализа. ДНК выделяли с помощью комплекта реагентов «ДНК-экспресс-кровь-плюс» («Литех», Россия), затем выполняли ПЦР– ПДРФ анализ. Для генотипирования (rs1061581 и rs1800629) использовали праймеры, синтезированные «Медиген» (Новосибирск, Россия) и «Евроген» (Москва, Россия), эндонуклеазы рестрикции PstI и TaaI от Thermo Fisher Scientific (Литва) соответственно. Структура использованных праймеров и условия проведения ПЦР детально изложены в работах [13, 14]. Исследование rs9722 проводили с использованием коммерческих наборов от «Литех» (Москва, Россия). Электрофорез осуществляли в 1,5%-ном агарозном геле (rs1061581 и rs1800629) и 7,5%-ном полиакриламидном геле (rs9722), результаты реакций оценивали в проходящем УФ-свете после окрашивания этидиумом бромидом.

Точный критерий Фишера (двусторонний тест) для оценки различий между группами по частотам аллелей и генотипов выполняли с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1 (StatSoft, USA). Программу SNPStats применяли для проверки соответствия равновесию Харди – Вайнберга (χ²-тест) и логистической регрессии с целью выявления ассоциации изученных полиморфных локусов с ХРИ для нескольких генетических моделей [15]. Результаты регрессионного анализа представляли в виде отношения шансов ( OR ), 95%-ного доверительного интервала (95 % CI ) и точного уровня значимости р .

Результаты и их обсуждение. Распределение частот генотипов изученных полиморфизмов соответствовало равновесию Харди – Вайнберга во всех обследованных группах. Только для полиморфного варианта HSPA1B (+1267A/G) выявлены различия по частоте аллелей и генотипов между группами 1 и 2 (табл. 1). Об этом свидетельствовала повышенная частота носительства как редкого G-аллеля ( р = 0,003), так и GG редкой гомозиготы ( р = 0,005) в группе 2 относительно группы 1. У 23,2 % пациентов (у 19 из 82) группы 2 был обнаружен GG-генотип, при этом 95 % (19 из 20) его носителей имели диагноз ХРИ. Следует отметить, что проведенное исследование определило только двух носителей редкой АА-гомозиготы rs1800629 в группе 2 и полное отсутствие носителей ТТ-гомозигот rs9722 в обеих группах работников.

Распределение генотипов полиморфного локуса +1267A/G HSP1AB гена у индивидов в обследованных группах обобщено в табл. 2. Полученные результаты указывают на то, что только для носителей GG-генотипа выявлены значимые отличия при сравнении данных группы 1 с таковыми группы 3. Особо отметим отсутствие различий частот носительства генотипов (в том числе и GG) при сравнении когорты работников, подвергшихся хронической ртутной интоксикации (группы 1 и 2), относительно субпопуляционной выборки из мужчин, представленной группой 3.

Таблица 1

Распределение аллелей и генотипов полиморфных вариантов HSP1AB , TNF-α и S100B генов

Ген (полиморфный локус), аллели и генотипы	Группа 1, n = 46	Группа 2, n = 82	p*
HSPA1B (rs1061581)
А	68 (0,74)	90 (0,55)	0,003
G	24 (0,26)	74 (0,45)
AA	23 (0,5)	27 (0,33)	0,062
AG	22 (0,48)	36 (0,44)	0,714
GG	1 (0,02)	19 (0,23)	0,005
TNF-α (rs1800629)
G	78 (0,85)	146 (0,89)	0,331
A	14 (0,15)	18 (0,11)
AA	0 (0)	2 (0,02)	0,536
AG	14 (0,3)	14 (0,17)	0,118
GG	32 (0,7)	66 (0,8)	0,194
S100B (rs9722)
C	83 (0,9)	143 (0,87)	0,547
T	9 (0,1)	21 (0,13)
СС	37 (0,8)	61 (0,74)	0,518
СТ	9 (0,2)	21 (0,26)
TT	0 (0)	0 (0)

П р и м е ч а н и е : приведены абсолютные значения (относительная частота); * – точный критерий Фишера, df = 2.

Обсуждая распределение генотипов изученных полиморфных локусов, отметим, что в объединенной группе и группе 3 частота носительства GG- HSP1AB (+1267A/G) генотипа (0,16 и 0,17 соответственно) была сопоставима с таковой в польской когорте (0,17) [6]. Обращает на себя внимание, что во всех названных группах частота носительства данного генотипа была несколько ниже, чем в группе 2 (0,23). Что касается носительства редкой АА- TNF-α (–308G/A) гомозиготы (только два носителя в группе пациентов с ХРИ), ее частота в группе

2 (0,02) была несколько выше таковой в итальянской и греческой (0,009 и 0,014), но ниже, чем в немецкой, французской и польской выборках (0,027, 0,029 и 0,031 соответственно) [6]. К сожалению, в изученной нами когорте не было выявлено носителей ТТ- S100B (C/T, rs9722) гомозиготы. Как следует из данных литературы, частота носительства названного генотипа довольно низка. В частности, для двух контрольных когорт в шведском исследовании (421 и 372 индивида) она составила 0,010 и 0,013 (4 и 5 человек соответственно) [9]. Однако в исследовании пациентов с депрессией в китайской популяции частота носительства редкой ТТ-гомозиготы была значительно выше – 0,15 [16]. Можно предположить, что в последнем случае повышенная частота носительства названного генотипа была обусловлена не только ассоциацией с заболеванием, но и принадлежностью обследованных к другой расовой группе – монголоидной.

В табл. 3 представлены результаты логистической регрессии для основных генетических моделей. Для локуса HSP1AB (+1267A/G) проведенный анализ выявил, что гомозиготный по редкому аллелю GG-генотип ассоциирован с риском развития ХРИ (рецессивная модель, OR = 13,57 ( p < 0,0001); аддитивная модель, OR = 2,32 ( p = 0,0026)). При этом меньшее значение информационного критерия Акаике для рецессивной модели (AIC = 158,6) указывает на то, что она предпочтительней аддитивной (AIC = 162,1). Следует отметить, что анализ моделей для rs1800629 и rs9722 полиморфизмов не выявил значимых ассоциаций с ХРИ. Для S100B (C/T, rs9722) локуса была проанализирована только кодоминантная модель (CC/CT) из-за отсутствия в группах обследованных носителей редкой ТТ-гомозиготы. Генетические модели, скорректированные на стаж работы в контакте с ртутью, не обнаружили более значимой ассоциации с ХРИ.

Таблица 2

Распределение в группах генотипов полиморфного локуса +1267A/G HSP1AB гена

Генотип	Группа 1, n = 46	Группа 2, n = 82	Группы 1 и 2, n = 128	Группа 3, n = 298	р 1 / р 2 / р 3 *
AA	23 (0,5)	27 (0,33)	50 (0,39)	109 (0,36)	0,103/0,604/0,663
AG	22 (0,48)	36 (0,44)	58 (0,45)	139 (0,47)	1,000/0,708/0,833
GG	1 (0,02)	19 (0,23)	20 (0,16)	50 (0,17)	0,006/0,197/0,887

П р и м е ч а н и е : приведены абсолютные значения (относительная частота); * р ₁ / р ₂ / р ₃ – точный критерий Фишера ( df = 2) при сравнении групп 1, 2 и 1+2 с группой 3 соответственно.

Таблица 3

Ассоциация изученных полиморфных локусов HSP1AB , TNF-α и S100B генов с формированием ХРИ

Ген (полиморфный локус)	Редкий аллель	Модель	OR (95 % CI ), p	AIC
HSPA1B (rs1061581)	G	AA/AG-GG AA-AG/GG AA-AG-GG	2,04 (0,97–4,27), 0,58 13,57 (1,75–105,09), 0,0004 2,32 (1,31–4,12), 0,0026	167,6 158,6 162,1
TNF-α (rs1800629)	A	GG/GA-AA GG-GA/AA GG-GA-AA	0,55 (0,24–1,57), 0,17 NA (0,00–NA), 0,18 0,69 (0,32–1,46), 0,43	169,3 169,4 170,2
S100B (rs9722) *	T	CC/CT	1,42 (0,59–3,42), 0,43	170,6

П р и м е ч а н и е : представлены результаты логистической регрессии для трех генетических моделей (сверху вниз): доминантной, рецессивной и аддитивной; NA – не определено; * – кодоминантная модель; AIC – значение информационного критерия Акаике.

Таблица 4

Ассоциация гаплотипов с формированием ХРИ, n = 128

Гаплотип	HSPA1B (+1267A/G)	TNF-α (–308G/A)	Частота	OR (95 % CI )	p
1	A	G	0,5447	1,00	–
2	G	G	0,3003	2,6 (1,27–5,32)	0,0098
3	G	А	0,0825	1,32 (0,45–3,89)	0,61
4	A	А	0,0425	0,38 (0,07–2,05)	0,26

На следующем этапе выполнен анализ гаплотипов для четырех возможных аллельных комбинаций локусов HSPA1B (+1267A/G) и TNF-α (–308G/A) (табл. 4). Только для G – G-гаплотипа выявлено значимое 2,6-кратное увеличение отношения шансов развития ХРИ ( OR = 2,6, CI 1,27–5,32, р = 0,0098). Значимость данного гаплотипа выглядит логичной, поскольку G- HSPA1B (+1267A/G) и G- TNF-α (–308G/A) аллели ассоциированы с выработкой высоких и пониженных уровней HSP70 и TNF-α соответственно [6]. Кроме того, между полиморфными локусами rs1061581 и rs1800629 отмечен значимый уровень ( р = 0,0004) неравновесного сцепления D ' = 0,459. Такие данные указывают на генетическое взаимодействие между локусами HSPA1B (+1267A/G) и TNF-α (–308G/A) в изученной когорте.

Расширение ранее сформированной когорты за счет восьми пациентов с диагнозом ХРИ, у троих из которых выявлено носительство GG- HSPA1B (1267A/G) генотипа, подтвердило обоснованность наших выводов на более раннем этапе исследований [1]. Кроме того, в настоящей работе установлено отсутствие различий в распределении генотипов в профессиональной когорте (группы 1 и 2) по сравнению с субпопуляционной выборкой (группа 3). Это позволяет предположить, что, несмотря на размер выборки обследованных работников, полученные результаты с большой вероятностью не являются ложноположительными. Отметим, что в проведенном исследовании в качестве генов-кандидатов были оценены полиморфные варианты HSPA1B , TNF-α и S100B генов, информация о которых отсутствует в последних специализированных обзорах, посвященных генетическим аспектам чувствительности к воздействию ртути [17, 18].

К настоящему времени существует понимание значимости того, как генетические варианты и полиморфизмы генов могут модифицировать нейротоксичность ртути в профессиональных когортах, для которых промышленные риски суммируются с экологическими [19]. Недавние исследования показали, что характер отложений неорганической ртути в тканях мозга людей, подвергшихся загрязнению окружающей среды, отличается от таковых у имевших острое или подострое воздействие высоких концентраций в производственных условиях [20]. В целом это обусловливает целесообразность проведения исследований генетического статуса работников для выявления гиперчувствительных индивидов, которым может быть причинен вред даже в случае воздействия относительно невысоких уровней токсиканта [19]. Представляется обоснованным, если такие подходы будут реализованы для персонала, привлекаемого к работам по ликвидации накопленного вреда на промплощадке бывшего ООО «Усольехим-пром», где только что завершен демонтаж наземной части самого опасного объекта на территории – цеха ртутного электролиза.

Выводы . Полученные в настоящей работе результаты позволяют заключить, что носители гомозиготного по редкому аллелю GG- HSPA1B (+1267A/G) генотипа имеют высокий прогностический риск развития хронической ртутной интоксикации.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБНУ ВСИМЭИ (№ 0534-2016-0006).