Биохимическая характеристика целлюлозоразлагающих бактерий гидротерм Хойто-гол

Целлюлоза является самым распространенным углеводным биополимером на Земле, основными продуцентами которого служат высшие растения и зеленые водоросли. Столь большое количество целлюлозы в природе обусловливает важную роль разлагающих ее микроорганизмов в процессах минерализации и в круговороте углерода [1]. Целлюлозоразлагающие бактерии (ЦРБ) находятся в начале трофической цепи. Они гидролизуют полимерный органический субстрат целлюлозу, образуя растворимые органические соединения, используемые далее аэробными и анаэробными бактериями-деструкторами [2].

Целью данной работы было изучение физиолого-биохимических особенностей целлюлозоразлагающих бактерий в микробных сообществах гидротермы Хойто-Гол.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования были три типа микробных матов гидротермы Хойто-Гол (Восточные Саяны): темно-зеленый, белый и черно-зеленый. Темно-зеленый и черно-зеленый маты состояли в основном из цианобактерий; белый мат был представлен бесцветными серными бактериями.

Минеральные источники Хойто-Гол расположены на конусе выхода реки Аршан (приток реки Хойто-Гол) в горной системе Восточных Саян. Хойто-Гол – это группа из пяти выходов термальных вод, температура которых варьирует от 30,5 до 34,40С с суммарным дебитом до 13 л/с. Источники расположены по одной линии, вниз по течению одноименной реки и удалены друг от друга на 50-100 м. Тип минеральных вод – термальный углекисло-азотный, гидрокарбонатно-натриево-кальциевый. Минерализация воды составляет ~0,6 г/дм3. Характерной особенностью воды источников Хойто-Гол является присутствие сероводорода – до 7,0 мг/л [3]

Учет численности ЦРБ, использующих в качестве основного источника углерода целлюлозу, проводили методом предельных разведений на элективной среде Пфеннига следующего состава (г/л): KH 2 PO 4 – 0,3; MgCl 2 ∙2H 2 O – 0,3; NH 4 Cl – 0,3; CaCl 2 – 0.3; дрожжевой экстракт – 0,5. Рост ЦРБ учитывали визуально по разложению фильтровальной бумаги. Инкубировали при 30⁰С [4].

Выделение чистых культур, полученных путем последовательных посевов предельными разведениями производилось на среде с субстратом натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) в количестве 3 г/л и с последующим выделением колоний на агаризованной среде Пфеннига. Чистоту выделенных культур микроорганизмов проверяли визуальным и микроскопическим контролем. Микроскопический контроль проводился с препаратами фиксированных окрашенных клеток с иммерсионной системой и с препаратами живых клеток при помощи световых микроскопов PZO (Польша) и Axiostar plus (Karl Zeiss), снабженного фазово-контрастным устройством и фотодокументирующей системой.

Культуральные и физиолого-биохимические свойства данных культур исследовали по стандартным методикам. Тест на каталазу проводили на предметном стекле, помещая каплю биомассы в каплю 3% перекиси водорода. О наличии каталазы судили по образованию пузырьков газа [5].

Результаты и обсуждение

В исследуемых матах источника Хойто-Гол численность бактерий варьировала от 100 до 1000 кл/мл. Максимальный рост ЦРБ был отмечен в пробах Ц2 (белый мат) и Ц3 (черно-зеленый мат). Консорциум накопительных культур состоял из спорообразующих и неспорообразующих форм. В нем присутствовали морфологически различающиеся палочковидные клетки, часть из которых имела споры (рис. 1).

Клетки изолированных культур: Ц1 – кокки диаметром до 0,83 мкм, Ц2 и Ц3 – прямые палочки толщиной 0,5-0,7 мкм и длиной 0,8-1,5 мкм (рис. 2). Грамотрицательные, неспорообразующие подвижные. Все культуры каталазоположительные, аэробы. Колонии бактерий круглые с выпуклым профилем и ровным краем 1,0-1,2 мм в диаметре с мелкозернистой структурой. Цвета колоний были молочными, кремовыми с различной консистенцией (табл. 1). Исследуемые микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма.

Рис. 1. Формы бактерий в целлюлозоразлагающем сообществе

Таблица 1

Дифференцирующие свойства идентифицируемых бактерий

Свойства	Ц 1		Ц2	Ц3
Описание пробы	темно-зеленый мат		белый мат	черно-зеленый мат
Описание поверхностной колонии
Форма и поверхность	Круглая, гладкая		Круглая, гладкая	Круглая, гладкая
Размер, мм	1,0-1,2		1,0-1,2	1,0-1,2
Цвет	Молочный		С желтоватым оттенком	Молочный
Край, профиль	Гладкий, выпуклый		Гладкий, выпуклый	Гладкий, выпуклый
Блеск и прозрачность	Блестящая, непрозрачная		Блестящая, непрозрачная	Блестящая, непрозрачная
Поверхность	Гладкая		Гладкая	Гладкая
Структура	Мелкозернистая		Мелкозернистая	Мелкозернистая
Консистенция	Вязкая, слизистая		Плотная	Плотная
Морфология клеток и цитология
Морфология	Кокки		Прямые палочки	Прямые палочки
Размеры, мкм	0,6-0,9		0,5-0,7 х 0,8-1,2	0,5-0,7 х 1,0-1,5
Окраска по Граму	-		-	-
Подвижность	+		+	+
Эндоспоры	-		-	-
Кислотоустойчивость	-		-	-
Физиолого-биохимические свойства
Ксилоза		+	+	+
Глюкоза		+	+	+
Лактоза		-	+	+
Мальтоза		+	+	+
Рафиноза		-	-	+
Галактоза		+	+	+
Фруктоза		-	+	+
Сахароза		-	+	+
Рамноза		-	-	-

Целлобиоза	+	-	-
Этанол	-	+	+
Сорбит	-	-	-
Глицерин	-	-	+
Маннит	-	-	+
Дульцит	-	-	+
Цитрат	-	-	-
Лактат	-	-	-
Пируват	-	+	+
Ацетат	-	+	+
Сукцинат	-	+	+
Мочевина	-	-	-
L-цистеин	-	-	-
Казеинолитическая активность	-	-	-
Амилолитическая активность	-	+	+
Тест на каталазу	+	+	+

Культура Ц1 использовала узкий спектр полимерных углеводных субстратов и сахаров: глюкозу, целлобиозу, ксилозу, мальтозу, галактозу. Не использовала натриевые соли органических кислот, спирты, белковые субстраты. Культура Ц2 росла на среде с пептоном и ксилозой, глюкозой, лактозой, мальтозой, галактозой, фруктозой, сахарозой, этанолом, а также с натриевыми солями пировиноградной, уксусной и янтарной кислот. Организм не использовал рафинозу, рамнозу, целлобиозу, многоатомные спирты, натриевые соли лимонной и молочной кислот. Культура Ц3 использовала в качестве единственного источника углерода многие углеводы, спирты и соли органических кислот, кроме рамнозы, целлобиозы, сорбита, лактата и цитрата натрия. Все выделенные культуры не усваивали азот мочевины и цистеина.

Для определения внеклеточных ферментов использовали следующие высокомолекулярные соединения: крахмал и казеин. Крахмал подвергался гидролитическому расщеплению под действием амилаз. Амилолитическая активность была выявлена в культурах Ц2 и Ц3, диаметр светлой зоны у которых достигал 5 мм. В культуре Ц1 гидролитического расщепления крахмала не наблюдалось. Для выявления протеолиза казеина использовали молочный агар. Отличительной особенностью всех изолятов является отсутствие роста на гидролизате казеина.

Рис. 2. Выделенные культуры микроорганизмов из проб матов Хойто-Гол: А – культура Ц1; Б – культура Ц2;

В – культура Ц3.

Таким образом, определение физиолого-биохимических особенностей целлюлозоразлагающих бактерий в микробных сообществах гидротерм Хойто-Гол показало, что исследуемые микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма.