Биохимические особенности раститель­ных источников прополиса умеренной природной зоны

Прополис образуется в результате переработки пчелами смолистых выделений растительного происхождения. В ульях прополис служит для пчел защитным средством от инфекций, и поэтому неудивительно, что прополис характеризуется антибактериальным и противогрибковым действием. Также прополис в ульях является строительно-ремонтным материалом. Наряду с мёдом, это один из важнейших продуктов пчеловодства, который используется в пищевой, косметической и фармакологической промышленности [Поправко, Гуревич, Колосов, 1969].

Пчёлы производят прополис с помощью веществ первичного и вторичного метаболизма, образующихся в органах растений в результате различных биохимических процессов. Компоненты прополиса – это вещества, активно выделяемые или вырабатываемые растениями при их повреждении: липофильные выделения, клейковины, смолы, латексы и др. на листьях, почках и других частях растения. В состав прополиса входят: флавоны (хризин, тектохризин, лютеолин, апигенин и др.), флавонолы (кверцетин, кемпферол, галангин, изиальпинин, рамоцитрин), флавононы (пиноцем-бирин, пиностробин и др.), фенольные кислоты (транс-кофейная, транс-кумаровая, транс-феруло-вая, коричная, ванилиновая и др.). Фенольные соединения, входящие в состав прополиса, относятся к биологически активным веществам. Они облада- ют выраженными антибактериальными свойствами. Кроме того, фенолокислоты обладают вяжущим действием, что способствует заживлению ран и язв. Эти соединения обладают также желчегонным, мочегонным, капилляроукрепляющим и противовоспалительным действием. Установлено также наличие терпеноидов, а-ацетоксибетуленола, бисаболола и ароматического альдегида изованилина. В прополисе содержится бензойная кислота, обладающая выраженной способностью задерживать рост и развитие микроорганизмов, а также сложные эфиры органических кислот с конифери-ловым, коричным и другими спиртами. Ненасыщенные жирные кислоты прополиса, поступающие с секретом мандибулярных (верхнечелюстных) желез рабочих пчёл обладают противоокислительны-ми свойствами. Прополис содержит в небольших количествах разнообразные витамины: B1 (4–4.5 мгк/г), В2 (20–30 мкг/г), В6 (4.5–6 мкг/г), А, Е, никотиновую, пантотеновую кислоты и др. В составе прополиса имеются азотистые соединения – белки, амиды, амины, а также такие аминокислоты, как фенилаланин, гистидин, аспарагиновая, глутаминовая, триптофан, лейцин, цистин, валин, серин, аргинин, пролин, лизин [Greenaway, Scaysbrook, Whatley, 1990].

Особенности химического состава разных ботанико-географических типов прополиса зависят от своеобразия флоры в месте сбора и, следовательно, от природно-климатических особенностей террито-

рии сбора. Каждый вид растений выделяет специфическую смесь фенольных соединений, что отражается в составе прополиса и его биологически активных свойствах [Popova et al., 2007].

В настоящее время выделяют несколько ботанико-географических типов прополиса. В тропических областях прополис собирается с растений родов: клузия ( Clusia L.), бакхарис ( Baccharis L.), квиллайя ( Quillaja Molina). Прополис тропической области характеризуется содержанием прениловых производных p-кумаровой кислоты и ацетофенона. Обнаружены также дитерпены, лигнаны и флавоноиды, отличные от тех, что находятся в прополисе умеренной зоны [Trusheva et al., 2004, 2006; Hernandez et al., 2005; Salatino et al., 2005].

В умеренных широтах источником прополиса являются растения родов: тополь ( Populus L.) и береза ( Betula L.). Прополис умеренной зоны содержит типичные фенольные соединения смол почек тополя: фенольные кислоты и их сложные эфиры (наиболее распространенные: бензойная и кофейная кислоты), флавоны и флаваноиды [Popova et al., 2013]. Биологические свойства прополиса умеренной зоны, в первую очередь, обусловлены наличием фенольных соединений (флавоноидов и фенольных кислот).

Цель нашего исследования – выявление биохимических особенностей растительных источников прополиса умеренной природной зоны. Главными составляющими водорастворимой фракции прополиса и смолистых выделений растений являются фенольные кислоты и свободные аминокислоты [Greenaway, Scaysbrook, Whatley, 1990]. Эти соединения являются основными действующими веществами прополиса умеренной зоны (тополиного и березового типа).

Материал и методы исследований

Материалами исследования послужили почки, листовые пластинки и черешки растительных источников прополиса умеренной природной зоны: тополя черного ( Populus nigra L.), осины или тополя дрожащего ( P. tremula L.) и березы повислой ( Betula pendula Roth). В объектах определяли содержание фенольных кислот (бензойной и кофейной), а также свободных аминокислот (гистидина и фенилаланина).

Экстракцию органических кислот проводили путем кипячения растительного материала в дистиллированной воде в течение 5 мин., с последующим центрифугированием и фильтрованием экстрактов.

Содержание органических кислот определяли в приготовленных экстрактах растительных источников прополиса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе Ultimate 3000 (Dionex, Германия). Тип хроматографической колонки – Acclaim^® C 18 ; 3 мкм; 120 Ǻ;

2.1×210 мм. В качестве подвижной фазы использовались элюэнты: ацетонитрил (ОСЧ для ВЭЖХ) и фосфатный буфер (40 мМ КН 2 РО 4 с рН 5.5 для аминокислот и рН 2.9 для фенольных кислот).

Для статистической обработки данных использовали программу SigmaPlot 11.0. с применением методов описательной статистики (точность опыта – коэффициент Стьюдента, средние значения, стандартное отклонение) и дисперсионного анализа (критерий Фишера, показатель наименьшей существенной разницы, далее НСР).

Результаты и их обсуждение

Данные по содержанию органических кислот в растительных источниках прополиса представлены в табл. 1 и 2.

Содержание фенольных кислот

Нами изучено содержание важнейших представителей фенольных кислот растений: бензойной и кофейной.

Бензойная кислота – простейшая одноосновная карбоновая кислота ароматического ряда. Представляет собой белые кристаллы, плохо растворимые в воде, хорошо растворимые в спирте. В свободном виде встречается в составе многих растений. По данным разных авторов, бензойная кислота обладает выраженными биологически активными и фармакологическими свойствами. Доказано её фунгицидное и антисептическое действие [Popova et al., 2007], противовоспалительный эффект [Paulino et al., 2009]. Бензойная кислота и её производные широко используются в качестве консервантов в пищевой промышленности.

Кофейная кислота (3,4-диоксикоричная кислота) является непредельной ароматической органической кислотой. Содержится во всех растениях и участвует в биосинтезе лигнина. Представляет собой желтые кристаллы, плохо растворимые в воде. Кофейная кислота обладает ценными биологически активными качествами. Установлены антиоксидантные, противовирусные, противоопухолевые, противоязвенные, гепатопротекторные, противовоспалительные и иммуномодулирующие свойства кофейной кислоты [Paulino et al., 2009].

По содержанию фенольных кислот в растительных источниках прополиса выявлены некоторые видовые особенности и установлена дифференциация по органам растений. Бензойная кислота обнаружена в единичных образцах исследуемых органов тополя, с наибольшим содержанием в черешках. У осины бензойная кислота обнаружена лишь в единичных образцах почек. В органах березы бородавчатой содержание бензойной кислоты было ниже 1.0 мг/100 г (табл. 1).

Кофейная кислота обнаружена во всех органах исследуемых видов растений, за исключением листьев берёзы бородавчатой. В листьях березы орга- нические кислоты нами не анализировались. Максимальное содержание кофейной кислоты установлено в почках тополя чёрного, при этом в листьях и черешках тополя чёрного достоверных отличий по содержанию кофейной кислоты нет. Почки осины и березы достоверно не отличались по содер- жанию кофейной кислоты между собой. Достоверность различий между вариантами (видами и органами растений) оценивали по критерию Фишера и величине наименьшей существенной разности (НСР).

Таблица 1

Содержание фенольных кислот в растительных источниках прополиса, мг/100 г

Вид растения	Орган растения
	Почки		Листья		Черешки
	Бензойная кислота	Кофейная кислота	Бензойная кислота	Кофейная кислота	Бензойная кислота	Кофейная кислота
Тополь чёрный	12 – 33	579±103.8 t оп =5.58 t ст = 2.78	3.9 – 29.4	19.8±1.92 t оп =10.3 t ст =2.45	24.9 – 65.7	18.3±4.149 t оп =4.41 t ст =2.57
Осина (Тополь дрожащий)	58,2*	37.2±14.2 t оп =2.62 t ст =2.57	н.о.	19.8*	н.о	8.7*
Береза повислая	н.о.	15.12±2.04 t оп =7.4 t ст =2.78	н.а.	н.а	н.о.	9.9*

Примечания: * – единичные образцы, ± – стандартное отклонение, t оп – критерий Стьюдента расчетный, t ст – критерий Стьюдента табличный, результаты достоверны при t оп >t ст ; н.о. – ниже предела обнаружения метода (менее 1.0 мг/100 г), н.а. – не анализировали.

Содержание аминокислот

Аминокислоты гистидин и фенилаланин обнаружены во всех исследуемых образцах, за исключением листьев березы бородавчатой. Содержание аминокислот проявляет определенную зависи- мость от вида и органа растения. Почки исследуемых растений по содержанию гистидина достоверно друг от друга не отличались (табл. 2). У тополя чёрного достоверно повышенное содержание гистидина характерно для черешков.

Таблица 2

Содержание аминокислот в растительных источниках прополиса, мг/100 г

Вид растения	Орган растения
	Почки		Листья		Черешки
	Гистидин	Фенилаланин	Гистидин	Фенилаланин	Гистидин	Фенилаланин
Тополь чёрный	252.15±42.22 t оп =5.97 t ст =3.18	288±59.69 t оп =4.83 t ст =3.18	440±50.23 t оп =8.77 t ст =2.78	478.6±45.32 t оп =10.56 t ст =2.78	640.73±136.30 t оп =4.70 t ст =3,18	344.78±18.68 t оп =18.46 t ст =3,18
Осина (Тополь дрожащий)	202.05±25.05 t оп =8.07 t ст =3.18	399.15±16.35 t оп =24.41 t ст =4.30	875.70*	632.40*	467.70*	352.50*
Береза повислая	297.45±19.3 t оп =15.41 t ст =3.18	2323.58±276.9 t оп =8.39 t ст =3.18	н.а.	н.а.	180.90*	513.90*

Примечания: * – единичные образцы, ± – стандартное отклонение, t оп – критерий Стьюдента расчетный, t ст – критерий Стьюдента табличный, результаты достоверны при t оп >t ст ; н.а. – не анализировали.

Максимальное содержание фенилаланина установлено в почках березы, тополь и осина по этому показателю достоверно друг от друга не отличались.

Среди органов тополя чёрного наибольшее содержание фенилаланина характерно для листовых пластинок. Содержание фенилаланина в черешках и почках тополя чёрного статистически не отличалось.

Исследуемые аминокислоты выполняют важные физиологические функции.

Гистидин относится к ароматическим аминокислотам. Физиологической активностью обладает L-гистидин, который образуется в тканях растений. Синтетические формы (DL-гистидин и D-ги- стидин) характеризуются ограниченными биологически активными свойствами. Гистидин выполняет роль лиганда в металлорганических комплексах электрон-транспортных цепях митохондрий и хлоропластах клеток. Гистидин входит в состав гемоглобина (кислород-связывающий белок скелетных мышц и сердечной мышцы). При трансформации гистидина в организме образуется биогенный амин гистамин, который играет важную роль в аллергических и иммунных реакциях.

Фенилаланин является ключевой аминокислотой, которая участвует в биосинтезе многочисленных биологически активных веществ, и, прежде всего, фенольных соединений (полифенолов). Со- держание фенилаланина в прополисе может служить показателем его целебной активности.

Аминокислотный профиль прополиса может использоваться при классификации ботанико-географических типов прополиса.

Заключение

Наши исследования показали существенные различия по содержанию фенольных кислот и аминокислот в зависимости от вида растения и органа источников прополиса умеренной зоны: тополя чёрного, осины и березы бородавчатой.

Кофейная кислота поступает в прополис в основном из смолистых выделений тополя чёрного. Содержание бензойной кислоты в изученных частях растений существенно варьирует и проявляется не во всех образцах. Основным источником гистидина в прополисе умеренной зоны являются черешки тополя чёрного. Почки березы служат основным источником фенилаланина в прополисе умеренной зоны.

Наши исследования направлены на выявление биохимические особенности источников прополиса и установление биохимических маркеров ботанико-географического происхождения прополиса. Прополис разного ботанического и географического происхождения характеризуется антибактериальным и противогрибковым действием, однако функциональные свойства прополиса разных типов базируются на специфических биологически активных веществах. Этот факт важно учитывать при определении целесообразных областей применения того или иного типа прополиса. Такого рода исследования являются ценными для стандартизации прополиса и с точки зрения его практического применения, т.е. для более эффективного использования полезных свойств прополиса. В условиях нехватки сырья прополиса, особенно в последние годы, органы растительных источников прополиса можно использовать в качестве дополнительных ресурсов при получении биологически активных веществ в косметической, фармацевтиче- ской и пищевой промышленности.

Исследования проводятся в рамках Единого за-каз-наряда Министерства образования и науки Российской Федерации №4.3870.2011.