Биоэлектрокаталитическое восстановление кислорода бактериальными лакказами на электродах, модифицированных многостенными углеродными нанотрубками

Ферменты лакказы (benzenediol:oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2) находят практическое применение в различных отраслях промышленности: пищевой, текстильной, целлюлознобумажной, косметической [1, 2]. Благодаря способности быстро восстанавливать кислород лакказы применяются при создании биокатодов в биотопливных элементах [3, 4]. Ключевым моментом при разработке биокатодов топливных элементов является выбор способа иммобилизации фермента, который обеспечивал бы надежность, технологичность, воспроизводимость и стабильность получаемых характеристик. Особенностью строения активного центра лакказ является наличие Т1 центра – первичного акцептора электронов, который передает электроны в медный кластер Т2/Т3, где происходит связывание и разрывание связей кислород-кислород. Для доставки электронов в этот каталитический центр возможны 2 механизма – опосредованный медиаторами и прямой перенос электронов (ППЭ).

Медиаторный перенос электронов предполагает использование редокс-соединений, которые облегчают перенос электронов от электрода к центру Т1. Однако с практической точки зрения, отсутствие медиаторов упрощает процесс изготовления биокатодов. Прямой перенос электрона между электродом и лакказой возможен только в том случае, если фермент правильно ориентирован на поверхности электрода, т. е. активный центр Т1 находится достаточно близко к электроду для осуществления прямого переноса электронов [1, 3, 4]. Для достижения оптимальной ориентации фермента при изготовлении биокатодов в БТЭ используют такие методы иммобилизации как адсорбция и ковалентное связывание. Так как метод адсорбции основан на случайном закреплении молекул белка на поверхности электрода, это может приводить к заметному снижению эффективности прямого транспорта электронов. Именно поэтому перед закреплением фермента проводят модификацию электродов с помощью наноструктурированных материалов. В частности, углеродные нанотрубки (УНТ) могут использоваться для улучшения электрохимического контакта электродов с окислительно-восстановительными центрами ферментов. УНТ могут находиться в непосредственной близости к активному центру и тем самым способствовать прямому переносу электронов между ферментом и электродом [5]. Однако наличие только УНТ бывает недостаточно, поэтому нанотрубки дополнительно модифицируются полициклическими ароматическими соединениями (ПАУ), которые являются аналогами субстрата лакказ (антрацен, антрахинон, нафталин), что способствуют правильной ориентации фермента [6, 7]. Другим подходом для иммобилизации лакказ

Цель работы – выбор метода иммобилизации бактериальных лакказ Streptomyces carpinensis для формирования стабильных биоэлектродов, которые потенциально могут быть использованы как биокатоды в БТЭ.

Материалы и методы

Все реактивы, использованные в работе, были квалификации ХЧ и ЧДА и приобретены в Sigma-Aldrich.

Адсорбция лакказы на графитовом электроде. Грифели («STABILO», HB, 2 мм) очищали мелкодисперсной наждачной бумагой (Р1200). Адсорбцию проводили путем погружения в раствор фермента лакказы Streptomyces carpinensis (3.0 ± 0.2 мг/мл, буфер 20 мМ Tris-HCI, рН 8.0, 0.2 5М NaCl, 0.3 M имидазол) на 24 часа.

Адсорбция лакказы на карбоксилированных нанотрубках. Грифели («STABILO», HB, 2 мм) промывали дистиллированной водой и обрабатывали ультразвуком в ацетоне в течении 5 мин. Обработанные электроды сушили при 90 °С в течение 2 ч для удаления растворителя. Кар-боксилированные многослойные нанотрубки (МУНТ-COOH) серии «Таунит-М» («Нано ТЦ», Томск) диспергировали в диметилсульоксиде ультразвуком в течение 2 мин. Электроды погружали в полученную суспензию нанотрубок на 5 мин, после чего помешали в ток горячего воздуха на 2 ч для удаления избытка растворителя. Процедуру повторяли 4 раза. Адсорбцию проводили путем погружения в раствор фермента лакказы Streptomyces carpinensis (3.0 ± 0.2 мг/мл, буфер 20 мМ Tris-HCI, рН 8.0, 0.25М NaCl, 0.3 M имидазол) на 24 часа.

Ковалентное связывание лакказы. Активацию карбоксильных групп на модифицированных МУНТ-COOH электродах проводили путем погружения в раствор 1-циклогексил-(2-морфолиноэтил) карбодиимид метоп-толу-олсульфоната (3 мг/мл в фосфатном буферном растворе (0.1 М, рН = 7)) на 2 ч. Ковалентную сшивку проводили путем погружения в раствор фермента лакказы Streptomyces carpinensis (3.0 ± 0.2 мг/мл, буфер 20 мМ Tris-HCI, рН 8.0, 0.25М NaCl, 0.3 M имидазол) на 24 часа.

Для удаления избытка несвязанного белка во всех случаях электроды промывали цитратным буферным раствором рН 4.5.

Электрохимические измерения проводили при помощи гальванопотенциостата «IPC-micro» («Kronas», Москва, Россия), интегрированного с ПК. Измерения проводили по двухэлектродной схеме (электрод сравнения Ag/AgCl) в цитратном буфере с рН 4.5, объем ячейки – 4 мл. Перед измерением буферный раствор дегазировали, ячейка продувалась аргоном до содержания кислорода 0 мг/мл, содержание кислорода контролировали с помощью кислородного электрода. Для насыщения буферного раствора кислорода включалась мешалка (скорость перемешивания 200 об/мин). Измеряемым параметром являлась амплитуда сигнала изменения силы тока рабочего электрода, определяемая как разность между начальным и конечным значениями токов в анаэробных и аэробных условиях. Измерения проводились при постоянном потенциале рабочего электрода 200 мВ [1]. Для определения лакказ, способных только к прямому переносу электронов оценку изменения силы тока проводили только в присутствии кислорода. Для определения лакказ, способных только к медиаторному переносу электронов в ячейку добавляли раствор субстрата АБТС (концентрация в ячейке 790 мкмоль).

Результаты

В работе были сформирована три типа электродов. Фермент закрепляли на поверхности электрода простой адсорбцией (электрод A), методом адсорбции на предварительно модифицированном электроде многостенными углеродными нанотрубками (электрод B) и путем ковалентной сшивки фермента по карбоксильным группам МУНТ-СООН, (электрод C). Типичный вид зависимости изменения силы тока от времени представлен на рисунке 1.

Рисунок 1. Зависимость изменения силы тока от времени для электрода A. DET – прямой перенос электронов, MET – перенос электронов с помощью медиатора

Figure 1. The dependence of the current on time for electrode A. DET - direct electron transfer, MET -mediated electron transfer

Начальное изменение силы тока при насыщении ячейки воздухом соответствует прямому переносу электронов от электрода на активный центр фермента и дальнейшему восстановлению кислорода. Изменение силы тока после добавления АБТС соответствует медиаторному переносу электронов на активный центр фермента и дальнейшему восстановлению кислорода.

Для каждого типа электродов была определена операционная стабильность. Результаты представлены в виде зависимости плотности тока от числа измерений (рисунок 2).

Рисунок 2. Эксплуатационная стабильность электродов с различными типами иммобилизации фермента лакказы. A - адсорбция на графитовом электроде, B - адсорбция на графитовом электроде, модифицированном МУНТ, C - ковалентное связывание с COOH-МУНТ на графитовом электроде

Figure 2. Operational stability of electrodes with different types of laccase enzyme immobilization. A - adsorption on graphite electrode, B - adsorption on graphite electrode modified with MWCNT, C - covalent bounding with MWCNT-COOH on graphite electrode

Для каждого типа электродов выполнена оценка максимальной скорости восстановления кислорода ферментом в режиме ППЭ. Параметр определялся как тангенс наклона прямой падения тока рабочего электрода. Скорости составили: для электрода A – 3,1 ± 0,3 мА • 10-3/мин, для электрода B – 7,7 ± 0,4 мА • 10-3/мин и для электрода C – 66 ± 4 мА • 10-3/мин.

Обсуждение

Применение метода амперометрии для оценки активности иммобилизованных ферментов лакказ ранее рассматривалось в работах [10, 11]. Данный метод позволяет оценить возможности иммобилизованного фермента к прямому переносу электронов, а значит судить о правильности ориентации активного центра фермента относительно поверхности электрода, и кроме того выполнить оценку максимальной скорости восстановления кислорода лакказами в режиме ППЭ. Полученные данные позволяют заключить, что наиболее перспективным методом закрепления является именно ковалентная сшивка фермента по карбоксильным группам с МУНТ-СООН на поверхности электрода. Данный метод позволяет на порядок увеличить скорость прямого ППЭ по сравнению с адсорбцией фермента на предварительно модифицированном электроде.

Оценка операционной стабильности электродов показывает, что для простой адсорбции эффект ППЭ исчезает уже после 3-го измерения, а для адсорбции на МУНТ после 7-го измерения, что свидетельствует о десорбции белка. Подобное поведение лакказ было ранее отмечено в работах [12, 13–20]. При использовании метода ковалентной сшивки сигнал биоэлектрода оставался стабильным, по крайней мере, в течение 12 измерений, что подтверждает правильность выбранного подхода закрепления фермента для его правильной ориентации и соответствует литературным данным [9].

Заключение

Для рекомбинантных бактериальных лакказ Streptomyces carpinensis показана возможность прямого переноса электронов на кислород при иммобилизации на поверхности графитового электрода. Наиболее перспективным методом иммобилизации является ковалентное связывание фермента с модифицированными углеродными нанотрубками. Данный метод способствует правильной ориентации фермента и как следствие, увеличению скорости восстановления кислорода и стабильности биоэлектрода во времени. Разработанные биоэлектроды могут быть использованы в качестве катодов в биотопливных элементах.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках государственного задания № FEWG-2024-0003 (Биокаталитические системы на основе клеток микроорганизмов, субклеточных структур и ферментов в сочетании с наноматериалами).