Биологическая эффективность лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов антагонистов против возбудителя фузариоза льна масличного на фоне искусственного заражения in vitro

Введение. В лаборатории биометода ВНИИМК проводятся многолетние исследования по разработке биологических мер борьбы с болезнями масличных культур. В последние годы начаты исследования по разработке микробиологических методов снижения вредоносности наиболее распространенной болезни льна масличного – фузариоза.

В основе разработанной нами концепции целенаправленного создания микробиопрепаратов для защиты сельскохозяй- ственных культур от болезней лежит ступенчатый скрининг выделенных штаммов-антагонистов фитопатогенов, который включает первичную оценку антагонистической активности in vitro к наиболее распространенным и вредоносным возбудителям болезней методом двойных или встречных культур. Затем лабораторные образцы микробиопрепаратов, изготовленные на основе выделенных в первичном скрининге перспективных штаммов, оценивают на фоне искусственного заражения патогенами в лабораторных условиях во влажной камере и в почве [1; 2]. Так как применяемый нами метод агаровых блоков [3] для искусственного заражения возбудителями болезней подсолнечника и сои не подходит для культуры льна в связи с малыми размерами семян, мы модифицировали методы, разработанные для заражения фузариозом семян рапса и горчицы [4; 5].

В результате первичного скрининга к патогенным возбудителям фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var . orthoceras и Fusarium poae из 60 коллекционных штаммов антагонистов выделены 43 перспективных штамма, проявивших антагонистическую активность к обоим патогенам. Из них 15 перспективных штаммов грибов: T-1, T-2, T-3, T-4 Trichoderma sp., Tk-1 T. koningii , SM-1 Sordaria sp., Pv-3 Penicillium verrucosum , Pr-1 P. rugulosum , Pk-1 Penicillium vermiculatum , A-1 и И-3 Basidiomycetes, An-1 Aspergillus niger, Av-1 Aspergillus versicolor, Xk-1 Chaetomium olivaceum и Хк-3 Chaetomium globosum; 20 штаммов бактерий рода Bacillus : Fa 41, D 7-1, 5Б-1, K 1-2 Bacillus subtilis , 3-2, 3-3, 5-3, 11-2, 11-3, D 1-1, D 7-3, Fa 4-2, Fz 9, 01 корf Bacillus sp., Б-2, Б-4 B. circulans , P-9 B. polymyxa , Б-12, Б-5, Б (2-1) B. licheniformis и восемь штаммов бактерий из рода Pseudomonas : Oif 2-1, 16-2, Sgc-1, 14-4, 12-2, 15-1 Pseudomonas sp., Sgrc-1 P. fluorescens и 14-3 P. chlororaphis [6].

Настоящая работа посвящена первому этапу вторичного скрининга выделенных перспективных штаммов-антагонистов к наиболее распространенному возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Shyd. et Hans. var. orthoceras (App. et Wn.) Bilai.

Материалы и методы. На основе выделенных в первичном скрининге перспективных штаммов антагонистов изготавливали    лабораторные    образцы микробиопрепаратов в препаративной форме «жидкая культура» (ЖК) при глубинном культивировании штаммов на качалке, со скоростью вращения 200 об./мин., в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл, при объемах среды 150 мл. Грибы выращивали в течение 4-х суток на среде Рудакова [7], бактерии – в течение 2-х суток, из рода Bacillus – на среде Тайло-на-3 [8], а из рода Pseudomonas – на среде Кинга В [9]. Титр определяли методом серийных разведений [10].

Семена льна масличного сорта ВНИИМК 620 обрабатывали лабораторными образцами микробиопрепаратов вручную, в круглодонных колбах, с нормами расхода препарата 3,0 л/т, рабочей жидкости – 6,0 л/т и хранили в течение 3-х суток.

Патогенный изолят возбудителя фуза-риоза льна масличного Fusarium oxyspo-rum var . orthoceras предварительно выращивали на картофельно-сахарозном агаре (КСА) [8] в течение 15 суток при температуре 25 ^оС. Затем обработанные семена льна, по 20 шт. раскладывали на увлажненную стерильной водой фильтровальную бумагу, выстланную на поверхность 15-дневных колоний патогена, при этом верхнюю крышку чашки Петри выстилали стерильной фильтровальной бумагой, смоченной стерильной водой. Через 10 суток проводили учет поражения проростков льна возбудителем фуза-риоза. Повторность 3-кратная. К онтроль – чистые необработанные семена с заражением патогеном. Биологическую эффективность препаратов определяли по формуле [11]:

100 ∙ (а- b)

• a^, где С – биологическая эффективность, %; a – количество больных растений в контроле;

b – количество больных растений в варианте.

Результаты и обсуждение. В результате оценки лабораторных образцов микробиопрепаратов в препаративной форме ЖК на основе 43 штаммов антагонистов, выделенных в первичном скрининге, на фоне искусственного заражения льна масличного возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras в лабораторных условиях in vitro (в контроле поражение составило 85,9 %) выделено 20 перспективных штаммов-продуцентов, показавших биологическую эффективность, превышающую 70,0 % (табл. 1, 2, 3).

Таблица 1

Эффективность обработки семян льна масличного лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов грибов антагонистов на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro, через 10 суток

ЦЭБ, ВНИИМК, 2019 г.

№ п/п	Вариант	Титр, КОЕ/мл	Биологическая эффективность, %
1	Контроль	-	85,9*
2	T-1 Trichoderma sp.	2,8 × 109	88,2
3	T-2 Trichoderma sp .	3,0 × 109	76,5
4	T-4 Trichoderma sp .	3,5 × 109	76,5
5	T-3 Trichoderma sp.	3,8 × 109	64,7
6	Tk-1 Trichoderma koningii	2,9 × 109	58,8
7	Pv-3 Penicillium verrucosum	8,5 × 109	88,2
8	Pr-1 Penicillium rugulosum	6,8 × 109	52,9
9	Pk-1 Penicillium vermiculatum	8,5 × 109	41,2
10	И-3 Basidiomycetes	2,5 × 107	94,1
11	A-1 Basidiomycetes	2,8 × 107	64,7
12	Xk-1 Chaetomium olivaceum	6,5 × 107	64,7
13	Хк-3 Chaetomium globosum	8,8 × 107	76,5
14	SM-1 Sordaria sp.	7,8 × 107	23,5
15	An-1 Aspergillus niger	4,5 × 1010	76,5
16	Av-1 Aspergillus versicolor	1,5 × 1010	0

Примечание: * – поражено возбудителем фузариоза в контроле без обработки, %

Из 15 перспективных грибов антагонистов высокую эффективность против возбудителя фузариоза показали семь штаммов: T-1 Trichoderma sp., T-2 Trichoderma sp. , T-4 Trichoderma sp. , Pv-3 Penicillium verrucosum, И-3 Basidiomycetes , Хк-3 Chaetomium globosum, An-1 Aspergillus niger. При этом максимальная эффективность установлена у трех штаммов: И-3 Basidiomycetes (94,1 %), Pv-3 Penicillium verrucosum и T-1 Trichoderma sp . (88,2 %) (рис. 1).

Из 20 перспективных штаммов бактерий рода Bacillus выделены 11, эффективность которых на фоне искусственного зараже-130

ния возбудителем фузариоза превысила 70,0 % : 01 корf, D 1-1, Fa 4-1, Fa 4-2, 5-3, D 7-3, 3-3 и 11,3 Bacillus sp., Б (2-1) B. licheniformis, Б-2 и Б-4 B. circulans (табл. 2).

а                     б

Рисунок 1 – Влияние обработки семян льна масличного лабораторным образцом микробиопрепарата на основе перспективного штамма И-3 Basidiomycetes на развитие возбудителя фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var . orthoceras in vitro (а – вариант; б – контроль без обработки) через 10 суток, 2019 г. (ориг.)

Таблица 2

Эффективность обработки семян льна масличного лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов-антагонистов из рода Bacillus на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro, через 10 суток

ЦЭБ, ВНИИМК, 2019 г.

№ п/п	Вариант	Титр, КОЕ/мл	Биологическая эффективность, %
1	Контроль	-	85,9*
2	01 корf Bacillus sp.	2,4 × 1010	76,5
3	3-2 Bacillus sp .	1,8 × 1010	52,9
4	D 1-1 Bacillus sp.	1,6 × 1010	70,6
5	Fa 4-2 Bacillus sp.	2,1 × 1010	76,5
6	5-3 Bacillus sp.	3,1 × 1010	82,4
7	11-2 Bacillus sp.	2,0 × 1010	64,7
8	11-3 Bacillus sp.	3,6 × 1010	70,6
9	D 7-3 Bacillus sp .	3,4 × 1010	82,4
10	Fz 9 Bacillus sp .	3,6 × 1010	29,4
11	3-3 Bacillus sp .	3,4 × 1010	76,5
12	Fa 4-1 B. subtilis	2,4 × 1010	70,6
13	K 1-2 B. subtilis	2,8 × 1010	41,2
14	D 7-1 B. subtilis	2,4 × 1010	47,1
15	5Б-1 B. subtilis	2,6 × 1010	35,3
16	Б-2 B .circulans	8,5 × 108	94,1
17	Б-4 B. circulans	6,2 × 108	88,2
18	Б-5 B. licheniformis	3,6 × 1010	0
19	Б-12 B .licheniformis	4,8 × 1010	58,8
20	Б (2-1) B. licheniformis	3,9 × 1010	82,4
21	P-9 B. polymyxa	7,6 × 1010	41,2

Примечание: * – поражено возбудителем фу-зариоза в контроле без обработки

Максимальная эффективность установлена у штаммов Б-2 B. circulans (94,1 %), Б-4 B. circulans (88,2 %), а также 5-3 Bacillus sp . и Б (2-1) B. licheniformis (82,4 %) (рис. 2).

а                  б

Рисунок 2 – Влияние обработки семян льна масличного лабораторным образцом микробиопрепарата на основе перспективного штамма Б-2 Bacillus circulans на развитие возбудителя фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro (а – вариант; б – контроль без обработки), через 10 суток, 2019 г. (ориг.)

Из восьми перспективных штаммов бактерий псевдомонад выделены два штамма: Sgc-1 и 16-2 Pseudomonas sp., эффективность которых на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза составила 70,6 % (табл. 3, рис. 3).

Таблица 3

Эффективность обработки семян льна масличного лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов-антагонистов на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro, через 10 суток

ЦЭБ, ВНИИМК, 2019 г.

№ п/п	Вариант	Титр, КОЕ/мл	Биологическая эффективность, %
1	Контроль	-	85,9*
2	Sgc-1 Pseudomonas sp .	2,5 × 1011	70,6
3	12-2 Pseudomonas sp.	1,8 × 1011	64,7
4	15-1 Pseudomonas sp.	1,5 × 1011	64,7
5	Sgrc-1 P. fluorescens	3,5 × 1011	52,9
6	14-3 P. chlororaphis	3,8 × 1011	23,5
7	14-4 Pseudomonas sp.	2,5 × 1011	52,9
8	16-2 Pseudomonas sp.	1,8 × 1011	70,6
9	Oif 2-1 Pseudomonas sp.	2,5 × 1011	47,1

Примечание: * – поражено возбудителем фу-зариоза в контроле без обработки

а                 б

Рисунок 3 – Влияние обработки семян льна масличного лабораторным образцом микробиопрепарата на основе перспективного штамма Sgc-1 Pseudomonas sp . на развитие возбудителя фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro (а – вариант; б – контроль без обработки), через 10 суток, 2019 г. (ориг.)

Выводы. В результате вторичного скрининга 43 перспективных штаммов антагонистов к возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var . orthoceras in vitro выделено 20 перспективных штаммов-продуцентов, показавших биологическую эффективность, превышающую 70,0 %.

Из 15 перспективных грибных штаммов максимальная эффективность установлена у трех: И-3 Basidiomycetes (94,1 %), Pv-3 Penicillium verrucosum и T-1 Trichoderma sp. (88,2 % ).

Из 20 перспективных штаммов бактерий рода Bacillus максимальная эффективность установлена у четырех: Б-2 B. circulans (94,1 %), Б-4 B. circulans (88,2 %), а также 5-3 Bacillus sp. и Б (2-1) B. licheni-formis (82,4 %).

Из восьми перспективных штаммов бактерий рода Pseudomonas выделены два – Sgc-1 и 16-2 Pseudomonas sp., эффективность которых на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза составила 70,6 %.

Все выделенные перспективные штаммы антагонистов будут включены в следующий этап скрининга на фоне искусственного заражения льна масличного возбудителем фузариоза в почве.