Биологические свойства возбудителей бактериальных острых кишечных инфекций у телят и их антибиотикорезистентность

2020 по 2022 года, среди 598 ферм, пострадавших от неинфекционной диареи, штаммы кишечной палочки были обнаружены в 17,2% случаев [10].

Лечение данных заболеваний осложняется появлением антибиотикорезистентных штаммов возбудителей, по причине повсеместного нерационального использования антибиотиков. Эта проблема охватывает не только здравоохранение людей, но и ветеринарию [11, 12]. Так, например, частота случаев устойчивости к антибактериальным препаратам варьируется в диапазоне от 8,4% до 92,9% для E. coli [13]. Данные из Эфиопии подтверждают, что более половины изолятов E. coli от телят являются полирезистентными [14]. В Китае, результаты исследования кишечной палочки на антибиотикорезистентность показали, что штаммы были устойчивы к двум и более препаратам [8].

Цель работы – изучить морфологические, культуральные, антигенные свойства и отношение к антимикробным препаратам возбудителей острых кишечных инфекций у телят бактериальной этиологии.

Условия, материалы и методы. Исследования проводили на базе лаборатории микробиологии Центра биотехнологий Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина».

Источником биологического материала служили пробы, полученные от больных и павших телят из хозяйств Краснодарского края. Для анализа использовали следующие образцы: кровь, паренхиматозные органы, ткань головного мозга, фрагменты трубчатых костей, кишечник, а также фекальные массы.

Бактериологические исследования выполняли в строгом соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанных кишечных инфекций» (Москва, 2000). Определение родовой и видовой принадлежности выделенных бактерий базировалось на анализе их морфологических, тинкториальных и культуральных свойств. Выделение чистых культур и изучение их культуральных особенностей проводили с использованием коммерческих питательных сред (МПА, МПБ, среды Эндо и Энтеро; Оболенск, Россия). Кроме того, по стандартным методикам готовили кровяной агар. Для изучения морфологии и тинкториальных характеристик применяли окрашивание по Граму с помощью диагностического набора Микро-ГРАМ-НИЦФ (производство ЗАО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», г. Санкт-Петербург).

Антигенная формула кишечных палочек была установлена путем последовательного тестирования выделенных штаммов в реакции агглютинации на стекле коммерческим набором О-сывороток (производства Армавирской биофабрики) до положительного результата

Для получения 24-часовой культуры каждого штамма инкубирование питательных сред проводилось в термостате Binder FD53 (Германия) при температуре 37 °C. Контрольная идентификация микроорганизмов осуществлялась с использованием системы для масс-спектрометрического анализа «АЛМАСС Био 200» (Альгимед Техно).

Чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам (АБП) определяли диско-диффузионным методом (МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»). Для этого использовали стандартный инокулюм суточной культуры микроорганизмов, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда и содержащий примерно 1,5×10⁸ КОЕ/мл. Стандартный ино-кулюм наносили пипеткой на поверхность чашки Петри с МПА в объеме 0,25 мл, равномерно распределяли по поверхности шпателем Дригальского. После инокуляции на поверхность питательной среды наносили диски с АБП с помощью стерильного пинцета. Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри инкубировали в термостате при температуре 37 0 С в течение 18-24 ч.

Учет результатов проводили после инкубации, измеряя диаметр зон задержки роста тестируемого микроорганизма. Интерпретацию осуществляли на основании сопоставления результатов исследования

(диаметра зоны ингибиции роста) с пограничными значениями этих параметров, отделяющих чувствительные штаммы от промежуточных и промежуточные - от устойчивых.

Использовались противомикробные препараты следующих фармакологических групп. Гликопептиды – ванкомицин (30 мкг); аминогликозиды – гентамицин (10 мкг); тетрациклины – доксициклин (30 мкг), тетрациклин (30 мкг); полипептиды – колистин (300 ед); фторхинолоны – левофлоксацин (5 мкг), ципрофлоксацин (5 мкг); нитрофураны – фурадо-нин (300 мкг); цефалоспорины – цефуроксим (30 мкг); макролиды – эритромицин (15 мкг); сульфаниламиды (комбинированный препарат)    –    триметоприм/сульфаметоксазол

(1,25\23,75 мкг).

Выбор антибиотиков для исследования был обусловлен перечнем препаратов, применявшихся при лечении больных телят в хозяйствах.

Результаты и обсуждение. В ходе работы из патологического материала от больных телят были выделены 7 штаммов E. coli ( E 0202, E0502, E0702, E0802, E1102, E1302,

E1402), и по одному изоляту P. aeruginosa, E. faecalis.

При изучении морфологических и культуральных свойств изолятов E. coli установили (табл. 1), что все бактерии относятся к факультативным анаэробам, имеют строение прямой палочки (бациллы) с закруглёнными концами, размерами – 2 ... 6 мкм × 0,4 ... 0,6 мкм. Клетки располагаются одиночно или попарно, реже – короткими цепочками. Характерного скопления в виде «гроздьев» или длинных нитей не наблюдается. Хорошо растут на простых питательных средах при диапазоне температур 15-45 °C (оптимум 37 °C), pH 7,0-7,4.

Согласно литературным данным, E. coli на среде Эндо формирует колонии тёмнокрасного цвета с характерным металлическим блеском, что обусловлено расщеплением лактозы и связанным с ним сдвигом pH среды (изменение окраски индикатора). Среди изоля-тов встречаются как гемолитические (проявляющие а-гемолиз), так и негемолитические варианты. а-Гемолиз представляет собой частичное разрушение эритроцитов, при котором вокруг бактериальных колоний формируется зелёная или буровато-зелёная зона вследствие окисления гемоглобина до метгемоглобина. Данный тип гемолитической активности не сопровождается полным лизисом эритроцитарных клеток [15, 4].

Нами было установлено, что полученные нами штаммы лактозоположительные, так как колонии кишечной палочки на среде Эндо образуют темно-красные колонии с металлическим блеском. При посеве на МПА образовывали колонии средних размеров, серо-белые, гладкие, влажные, блестящие, с ровными краями (S форма). В жидких средах вызывали равномерное помутнение, иногда образуя незначительный осадок.

Отмечалось, что штаммы кишечной палочки, полученные нами на кровяном агаре, проявили а-гемолиз, так как культуры образовали буровато-зелёные зоны гемолиза.

При изучении антигенных свойств установили, выделенные изоляты принадлежат к разным сереологическим группам Е0202 к О4, Е0502 и E1302 к О137, E0702 к О1, Е0802 к О86, Е1102 к О2 и E1402 к О115.

При изучении морфологических и культуральных свойств Pseudomonas aeruginosa установили (табл. 2), что бактерии представляют из себя прямые или слегка изогнутые палочки с закруглёнными концами размерами

1,5 ... 3,0 мкм × 0,4 ... 0,6 мкм. Клетки располагаются одиночно, парами или короткими цепочками. По Граму окрашиваются отрицательно. Pseudomonas aeruginosa – аэроб, температурный оптимум - 35-37 °С, диапазон 442 °С, рН - 7,2.

Согласно литературным данным, на плотной среде (МПА) P. aeruginosa даёт полиморфный рост. Доминируют крупные (2–5 мм) колонии сероватой окраски, полупрозрачные, с гладкой поверхностью, приподнятым центром и неровными волнистыми распространяющимися краями, нередко отливающие металлическим блеском.

Таблица 1 – Сравнительная характеристика роста исследуемых культур Escherichia coli на питательных средах

Питательные среды	Характер роста	Морфология колоний	Морфология клеток
МПБ	Придонный рост	Осадок небольшой, сероватого цвета, легкоразбивающийся	Гр(-) палочка, 2 - 6 мкм х 0,4 - 0,6 мкм, расположенные одиночно, реже-попарно.
МПА	Рост в виде штриха, обильный	Колонии круглые, сферически выпуклые, с ровными краями или волнистыми краями, полупрозрачные, блестящие, мягкой консистенции, с голубоватым оттенком. Колонии диаметром 1,0-5,0 мм.
Эндо	Рост в виде колоний, умеренный	Тёмно-красные колонии с металлическим блеском
Кровяной агар	Рост в виде колоний, умеренный	Мелкие прозрачные колонии размером 1-2 мм образующие зону а-гемолиза
В жидкой среде (МПБ) рост P. aerugino-    ки часто окружены зоной в-гемолиза [16, 17]. sa характеризуется образованием на поверх-      В нашем случае отмечалось, что при посе- ности серебристо-белой плёнки (типичный   ве на МПА исследуемая культура синегной- видоспецифический признак). Впоследствии   ной палочки образовывала колонии крупного отмечается помутнение среды – сначала в   размера, сероватого цвета, полупрозрачные. В верхней части столбика, затем по всей высоте,   жидких средах вызывали равномерное помут- - а также формирование серовато-белого   нение, иногда образуя незначительный оса- осадка на дне пробирки. Благодаря продукции   док. пигментов среда окрашивается в сине-      Нами было установлено, что исследуемая зелёный цвет, который при длительном хране-   культура синегнойной палочки на кровяном нии постепенно переходит в бурый. На кровя-    агаре проявила в-гемолиз, так как вокруг коном агаре вокруг колонии синегнойной палоч-   лонии наблюдаются зоны полного гемолиза.

Таблица 2 – Сравнительная характеристика роста исследуемой культуры Pseudomonas aeruginosa на питательных средах

Питательные среды	Характер роста	Морфология колоний	Морфология клеток
МПБ	Поверхностный рост	Равномерное помутнение с сероватой пленкой на поверхности и осадком на дне	Гр(-) палочка, 1,53,0 × 0,4 мкм, расположенная одиночно , парами, короткими цепочками
МПА	Рост в виде штриха, обильный	Сероватые полупрозрачные крупные колонии 3-5 мм
Эндо	Рост в виде колоний, обильный	Большие розовые колонии
Кровяной агар	Рост в виде колоний, обильный	Сероватые полупрозрачные крупные колонии 3-5 мм образующие четкие зоны в-гемолиза

При изучении морфологических и культуральных свойств E. faecalis установили (табл. 3), что клетки представляют из себя сферические или овальные кокки 0,6–2,0 мкм в длину и 0,6–2,5 мкм в ширину. Клетки располагаются одиночно, парами или короткими цепочками. По Граму окрашиваются положительно. E. faecalis – факультативный анаэроб, температурный оптимум 35–37 °C, диапазон роста 10–45 °C, оптимальный pH 7,0–7,5.

В литературе указано, что в жидких средах отмечается диффузный рост (равномерное помутнение); на плотных средах формируются мелкие (0,4–1 мм) колонии округлой формы, выпуклые, с блестящей поверхностью, иногда сливающиеся в нежный налёт. Стандартная процедура идентификации E. faecalis базируется на высеве навески продукта или её разведения в жидкую селективную среду либо на поверхность плотной селективной среды, аэробной инкубации при 37±1 °С (48 ч), подтверждении принадлежности выделенных культур к роду Enterococcus и последующем пересчёте микробных клеток на единицу массы или объёма продукта (1 г или 1 см³). Колонии целевого микроорганизма окрашиваются в розовый или красный цвет [18, 19].

В качестве основной питательной среды для количественного учёта энтерококков применяется энтерококкагар. Среда обогащена 2,3,5-трифенилтетразолием хлористым (ТТХ) – соединением, которое восстанавливается бактериями до нерастворимого формазана, что визуально проявляется в виде тёмно-красного окрашивания колоний. Все колонии тёмно-бордового цвета, выросшие при инкубировании в течение 24 ч при повышенной температуре (44–45 °С), с большой вероятностью относятся к энтерококкам [18, 19].

На кровяном агаре колонии энтерококков мелкие, кремовые или белые, гладкие с ровным краем, различающиеся по типу гемолиза. [18, 19]

Таблица 3  – Сравнительная характеристика роста исследуемой культуры E. faecalis на питательных средах

Питательные среды	Характер роста	Морфология колоний	Морфология клеток
МПБ	Придонный рост	Равномерное помутнение с сероватой пленкой на поверхности и осадком на дне	Гр(+) круглые, 0,6 - 2 мкм, расположенные единично ,либо в виде небольших скоплений.
МПА	Рост в виде штриха, скудный	Мелкие сероватые полупрозрачные колонии до 1 мм
Энтерококк-агар	Рост в виде колоний, скудный	Мелкие темно-красного цвета колоний до 1мм
Кровяной агар	Рост в виде колоний, скудный	Мелкие сероватые полупрозрачные колонии до 1 мм. Характеризуются γ-гемолизом
Определение   антибиотикорезистентности   вость к широкому спектру лекарственных пре- выделенных штаммов показало их устойчи-   паратов (табл. 4).

Таблица 4 – Характеристика антибиотикоустойчивости штаммов исследуемых возбудителей, выделенных от больных телят

№	Антибиотик	Изоляты возбудителей острых кишечных инфекций
		E. coli							P.aeru ginosa	E. fae-calis
		Е0202	Е0502	E0702	Е0802	Е1102	E1302	E1402
1	Ванкомицин	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Ч
2	Гентамицин	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Ч	Ч
3	Доксициклин	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р
4	Колистин	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р
5	Левофлоксацин	Ч	Р	Р	Р	Ч	Ч	Ч	Ч	Р
6	Тетрациклин	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р
7	Триметоприм/ сульфаметоксазол	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р
8	Фурадонин	Р	Р	Р	Р	Р	Ч	Ч	Р	Р
9	Цефуроксим	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р
10	Ципрофлоксацин	Р	Р	Р	Р	Ч	Р	Ч	Ч	Ч
11	Эритромицин	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р	Р

Примечание: Ч - чувствителен к антимикробным препаратам; Р - резистентен к антимикробным препаратам

Выводы. В результате проведённых исследований были изучены морфологические, тинкториальные, культуральные и антигенные свойства трёх основных бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций телят – Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis , выделенных из биологического материала в хозяйствах Краснодарского края.

Установлено, что:

• E.    coli (7 штаммов) являются лактозоположительными, на среде Эндо образует тёмнокрасные колонии с металлическим блеском, на кровяном агаре проявляет а-гемолиз.

• P.    aeruginosa характеризуется образованием пигмента (сине-зелёное окрашивание сред), типичным ростом в МПБ с поверхностной плёнкой и выраженным в-гемолизом на кровяном агаре.

• E.    faecalis на энтерококкагаре формирует мелкие тёмно-бордовые колонии, на кровяном агаре —Y-гемолиз, растёт скудно на МПА.

Антигенное типирование выделенных штаммов E. coli позволило установить их О-серогруппы (О4, О137, О1, О86, О2, О137, 0115).

При оценке антибиотикорезистентности (11 препаратов из 9 групп) получены следующие результаты:

• 43 % штаммов E. coli обладают полной устойчивостью ко всем использованным антибиотикам;

Чувствительность к фторхинолонам (левофлоксацин, ципрофлоксацин) регистрируется лишь у части изолятов;

• P.    aeruginosa сохранила чувствительность к гентамицину, левофлоксацину, ципрофлоксацину;

• E.    faecalis есть чувствительной только к ванкомицину, гентамицину и ципрофлоксацину, но устойчива к большинству других препаратов.

Таким образом, морфологические и культуральные свойства возбудителей соответствуют типовым характеристикам, однако высокий уровень полирезистентности (особенно среди E. coli ) подтверждает необходимость постоянного мониторинга антибиоти-кочувствительности и пересмотра схем анти-биотикотерапии при бактериальных острых кишечных инфекциях у телят в условиях промышленного скотоводства.