Биосовместимость микроэлементов для получения обогащенных пищевых ингредиентов

Введение . В настоящее время железодефицитная анемия (ЖДА) – самое распространенное заболевание в мире среди женского населения. По данным Всемирной организации здравоохранения, более 2,5 млрд человек имеют скрытый дефицит железа. В Российской Федерации около

50 % населения испытывают недостаток железа, а также меди [1–4]. Это связано с негативной экологической ситуацией, сложившейся в ряде российских регионов, нервными перегрузками и влечет за собой нарушения системы питания, гормональный дисбаланс организма и сердечно- сосудистые заболевания. Проведенные исследования подтверждают, что ЖДА вызывают многие факторы, но микроэлементозы являются преобладающей причиной возникновения данного заболевания. Железо (Fe) – один из важнейших биокатализаторов в организме человека, присутствует в 2 формах: Fe2+ (восстановленное) и Fe3+ (окисленное), обладает редкой способностью быть как донором, так и акцептором электронов, является системой многих белков и ферментов [4, 5]. Марганец при лигандообразо-вании с дрожжами позволяет увеличить биодоступность микроэлементов в комбинации при обогащении биомассы [6, 7].

Основываясь на метаболизме дрожжей – сахаромицетов (окислительно-восстановительные реакции, протекающие в них во время клеточного дыхания), удается повысить эффективность процесса обогащения дрожжей микроэлементами за счет введения в дрожжевое молоко источников различных микроэлементов, углеводов и окислителя [8]. Особенность метаболизма хлебопекарных дрожжей и двух путей одновременного энергетического обмена позволяет получать более высокие биохимические показатели по биомассе. Для четко заданного процесса производства хлебопекарных дрожжей необходимо активное аэробное культивирование с уровнем кислорода выше критической концентрации. Сигнальная наследственность дрожжевой клетки заключается в корреляции биохимических процессов и процессов метаболизма. Недостаточное содержание в культуральной среде одного из макро- и микроэлементов приводит в сжатые сроки к деградации внутриклеточных резервов и одновременно меняет генетическую модель: какая-то часть генов усиливается в действии, другая – ликвидируется. Таким образом, дрожжи рода Saccharomyces являются перспективным объектом для получения обогащенных эссенциальными микроэлементами пищевых ингредиентов и создания на их основе новых видов пищевой продукции.

Существует ряд научно обоснованных принципов обогащения макро- и микроэлементами микроорганизмов с учетом первостепенных данных, актуальных для науки, о роли конкретных нутриентов для обеспеченности населения. Первый – критерии выбора основополагающих ингредиентов; второй – обогащение микроорганизмов только для использования в ингредиентах для продуктов массового потребления; тре- тий – обогащение не должно сказываться на безопасности конечного продукта; четвертый – обеспечение максимальной целостности обогащенных ингредиентов в процессе производства и хранения; пятый – содержание в обогащенном ингредиенте должно быть не менее 15 % от суточной потребности; шестой – количественное содержание нутриента должно быть рассчитано с учетом концентрации в сырье и ее сохранения на всем протяжении срока хранения.

Цель исследований – изучение совместимости микроэлементов для возможности сочетанного обогащения дрожжей и их ферментоли-затов железом и медью.

З адачи: проведение процесса биофортификации хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-581с железом и медью в присутствии соли марганца; установление технологических параметров получения обогащенных фер-ментолизатов дрожжей; исследование фракционного состава ферментолизатов дрожжей.

Объекты и методы. Объектами исследования в данной работе служили штаммы хлебопекарных дрожжей из коллекции микроорганизмов ВНИИ пищевой биотехнологии (лаборатории биотехнологии пекарных дрожжей) и соли железа, меди и марганца – источники микроэлементов.

В качестве солей – источников катионов микроэлементов использовали сульфат железа (FeSO 4 ×7H 2 O), сульфат меди (CuSO 4 ×5H 2 O) и сульфат марганца (МnSO 4 ×5Н 2 О), квалификация чистоты – ХЧ.

Культивирование дрожжей проводили на микробиологической качалке при скорости вращения 220 об/мин в колбах Эрленмейера объемом 750 см3 с 75,0 см3 стандартной среды (солодовое сусло 8 % СВ) в течение 18 ч при температуре 30 °С.

Количественное содержание сырого протеина в биомассе определяли по методу Кьельдаля на автоматической установке Vapodest (Gerhardt, Германия) согласно ГОСТ 13496.4-2019 ГОСТ 13496.4-2019 «Корма. Комбикорма. Комбикормовое сырье. Метод определения содержания азота и сырого протеина».

Накопление биомассы определяли весовым методом после культивирования, разделяя центрифугированием твердую и жидкую фракции.

Твердую фракцию получали отделением от фильтрата на лабораторной центрифуге ОПМ-16 в течение 12 мин со скоростью вращения 8000 об/мин.

Концентрацию микроэлементов исследовали с помощью метода атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией на приборе «КВАНТ-2.ЭТА» (РФ) согласно ГОСТ Р 56372-2015 «Комбикорма, концентраты и премиксы. Определение массовой доли железа, марганца, цинка, кобальта, меди, молибдена и селена методом атомно-абсорбционной спектроскопии», а также методом инверсионной вольтамперометрии (ИВ) согласно МУ 31-17/06 (железо) и МУ 31-04/04 (медь).

Статистическую обработку новых экспериментальных данных, полученных не менее чем в 3 повторностях, осуществляли методом однофакторного дисперсионного анализа с апо- стериорным критерием Тьюки при р < 0,05 с использованием программы Statistica 6.0.

Результаты и их обсуждение. Поскольку известно, что все двухвалентные металлы конкурируют за возможность «закрепления» в организме, а избыток одного с высоким содержанием любого из упомянутых в таблице 1 двухвалентных металлов может блокировать его встраивание [7, 9], на первом этапе была изучена совместимость используемых микроэлементов железа и меди, для исследования способов сочетанного обогащения дрожжей. Результаты по биосовместимости микроэлементов обобщены в таблице 1.

Таблица 1

Микроэлемент	Железо	Магний	Медь	Фосфор	Кальций	Хром	Марганец	Цинк
Железо	=	=	+	=	-	-	=	-
Магний	=	=	=	-	+	=	-	=
Фосфор	=	-	=	=	-	-	=	=
Цинк	-	=	-	-	-	=	-	=
Медь	+	=	=	=	=	-	=	-
Хром	-	=	-	-	=	=	-	+
Кальций	-	+	=	-	=	=	=	-
Марганец	=	=	=	+	+	-	=	-

Примечание: «+» - оптимальное; «-» - негативное; «=» - нейтральное.

Совместимость микроэлементов для выбора сочетанного обогащения Micronutrient compatibility for selecting combined enrichment

Исходя из данных таблицы 1, железо и медь обогащения в процессе культивирования клеток имеют преимущественную совместимость, а марганец по отношению к обоим металлам нейтрален, что свидетельствует о возможности обогащения данными микроэлементами. Использование железа и меди в сочетании с марганцем позволяет повысить биодоступность микроэлементов при встраивании [7].

Проведены сравнительные исследования способов фортификации микроэлементами (железом и медью) дрожжей Saccharomyces cerevi-siae 581c: 1-й способ «прижизненного» обогащения - при культивировании дрожжей; 2-й способ обогащения инактивированных клеток -после ферментативной деструкции клеточных полимеров [10-12].

Для получения фортифицированных микроэлементами (железом и медью) дрожжей на первом этапе выбран способ «прижизненного»

на питательных средах, в состав которых введены исследуемые микроэлементы. Добавление марганца осуществляли для исследования возможности повышения степени обогащения дрожжей микроэлементами.

Культивирование дрожжей проводили на питательных средах, содержащих соли в различных концентрациях и соотношениях: железо -25, 50 и 100 мг%, добавляя в каждом варианте медь (2,5 и 5,0 мг%) и марганец (5,0 и 10,0 мг%). Культивирование проводили в термостатируемом качалочном аппарате в течение 18 ч при температуре 30 °С, 220 об/мин; объем питательной среды - 75,0 см3. Результаты культивирования дрожжей представлены на рисунке 1 (железо+медь без марганца) и на рисунке 2 (железо+медь+марганец).

Концентрация микроэлементов,мг/100см3

Рис.1. Показатели сырого протеина и биомассы при культивировании дрожжей S. cerevisiae на средах, содержащих ионы железа, меди в различных соотношениях

Crude protein and biomass indices during cultivation of S. cerevisiae yeast on media containing iron and copper ions in different ratios

Рис. 2. Показатели сырого протеина и биомассы при культивировании дрожжей S. сerevisiae на средах, содержащих ионы железа, меди и марганца в различных соотношениях Indices of crude protein and biomass during cultivation of yeast S. cerevisiae on media containing iron, copper and manganese ions in different ratios

В результате культивирования при внесении в состав питательной среды 50 мг железа/100 см3, 2,5 мг меди/100 см3 и 5,0 мг марганца/100 см3 накопление биомассы увеличилось на 7,3 %, а содержание белка – на 15,5 %, что свидетельствует об активирующем действии подобранных концентраций ионов металлов на рост дрожжей и синтез белковых веществ (см. рис. 1, 2). Дальнейшее повышение содержания микроэлементов в питательных средах негативно сказалось на жизнедеятельности дрожжевых клеток.

Проведено микроскопирование дрожжей, обогащенных железом и медью в присутствии марганца. Результаты представлены на рисунке 3.

Содержание микроэлементов,мг/100 см3

Рис. 3. Результаты микроскопирования дрожжей, обогащенных микроэлементами Results of microscopy of yeast enriched with micronutrients

В результате микроскопирования дрожжей выявлено влияние различных дозировок микроэлементов, внесенных в питательную среду, на развитие дрожжевых клеток. Подтверждено, что подобранная концентрация солей (50 мг% железа, 2,5 мг% меди и 5,0 мг% марганца) оказывает положительное воздействие на рост и размножение дрожжей. При этом установлено, что повышение концентрации в среде меди и марганца оказывает негативное влияние на процессы генерации дрожжей: снижается коли- чество почкующихся клеток и повышается количество мертвых (см. рис. 3).

Таким образом, установлена возможность обогащения хлебопекарных дрожжей микроэлементами железом и медью, подобранными экспериментально. Уровень железа в 100 г дрожжей составил 90,7 мг, меди – 36,3 мг.

Далее исследовали уровень обогащения дрожжей при различных дозировках микроэлементов (рис. 4, 5).

Рис. 4. Результаты обогащения дрожжей микроэлементами в процессе культивирования на средах, содержащих 2,5 мг меди/100см3 и 5,0 мг марганца/100 см3 с различной концентрацией железа

Results of yeast micronutrient enrichment during culturing on media containing 2.5 mg copper/100cm3 and 5.0 mg manganese/100 cm3 with different iron concentrations

■ Железо _■ Медь

Содержание железа, мг%

Рис. 5. Результаты обогащения дрожжей микроэлементами в процессе культивирования, на средах, содержащих 5,0 мг меди/100 см3 и 10,0 мг марганца/100 см3 с различной концентрацией железа

Results of yeast enrichment with microelements in the process of cultivation on media containing 5.0 mg copper/100 cm3 and 10.0 mg manganese/100cm3 with different concentration of iron

Отмечено, что введение в питательную среду микроэлементов в дозировках 50 мг желе-за/100 см3, 2,5 мг меди/100 см3 и 5,0 мг марган-ца/100 см3 является предпочтительным для обогащения, позволяя достичь процента обогащения для железа – 90,7 %, для меди – 72,5 %, но при этом содержание марганца оказалось нулевым (см. рис. 4). Повышение концентрации марганца в среде до 10 мг%, а железа до 100 мг% негативно сказалось на степени фортификации дрожжей микроэлементами (см. рис. 5).

Проведены сравнительные исследования показателей обогащения железом и медью при культивировании дрожжей на средах, содержащих указанные ионы металлов в присутствии марганца (см. рис. 4, 5) и в отсутствие марганца (рис. 6, 7). Установлено, что наличие марганца в питательной среде с подобранной экспериментально концентрацией железа и меди способствует повышению степени встраивания железа в 1,7 раза, меди – в 2,3 раза (см. рис. 4, 6). Данный факт подтвердил способность марганца принимать участие в процессах лигандообразо-вания и позволил повысить биодоступность микроэлементов с ним в сочетании, а комбинация с пищевыми лигандами, источником которых являются хлебопекарные дрожжи, подтверждает этот биохимический процесс.

Таким образом, изучена совместимость микроэлементов, установлена возможность смежного обогащения железом и медью в присутствии марганца и подобрана их целесообразная дозировка при культивировании дрожжей.

Ферментолиз является способом деструктурирования субклеточных структур дрожжей, при котором в мягких условиях происходит извлечение ценных нутриентов, а также снижение аллергенности [13–15]. Ферментативный гидролиз дрожжей осуществляли с применением ФП, обладающих субстратной специфичностью по отношению к белково-полисахаридным полимерам дрожжевой биомассы в 2 этапа: I – деструкция полимеров клеточной стенки под действием β-глюканаз (50,0 ед. β-ГкС/г), маннаназы (25,0 ед. МС/г) и протеаз (2,0 ед. ПС/г); II – гидролиз белков протоплазмы под действием протеаз (10,0 ед/г) [15]. После отделения жидкой фазы (растворимой части ферментолизата дрожжей) центрифугированием осуществлено осаждение белков этиловым спиртом в соотно- шении 1 : 3. Затем стадия центрифугирования и промывки осадка дистиллированной водой (пятикратно).

Далее проводили «встраивание» микроэлементов путем внесения растворов солей, содержащих ионы железа, меди и марганца в количестве: 50 мг железа/100 см3, 2,5 мг ме- ди/100см3 и 5,0 мг марганца/100 см3. Обогащение проводили в условиях постоянного перемешивания при n = (200 ± 20) RPM в течение τ = 30 мин, затем центрифугировали при n = 6000 RPM и анализировали на содержание микроэлементов.

Рис. 6. Результаты обогащения дрожжей микроэлементами в процессе культивирования на средах, содержащих 2,5 мг меди/100 см3 с различной концентрацией железа Results of yeast enrichment with microelements during cultivation on media containing 2.5 mg copper/100 cm3 with different concentration of iron

x о H

to

■ Железо ■ Медь

I I

Содержание железа, мг%

Рис. 7. Результаты обогащения дрожжей микроэлементами в процессе культивирования на средах, содержащих 5,0 мг меди/100 см3 с различной концентрацией железа Results of yeast enrichment with micronutrients during cultivation on media containing 5.0 mg copper/100 cm3 with different iron concentrations

Содержание микроэлементов составило: железа – 96,5 мг в 100 г ферментолизата и меди – 41,1 мг в 100 г ферментолизата (табл. 2).

Исследовали фракционный состав фермен-толизата дрожжей S. cerevisiaeY-581с . По сравнению с исходной биомассой в нем существенно сократилось содержание клетчатки, белков и высокомолекулярных пептидов; при этом повысилась концентрация аминокислот в свободной форме, низкомолекулярных пептидов и растворимых углеводов.

В результате ферментолиза обогащенной дрожжевой биомассы содержание полисахаридов сократилось в 13 раз, а растворимых углеводов и свободных аминокислот значительно увеличилось. Содержание низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой менее 1 000 Да и аминокислот в свободной форме достигло 37,5 и 18,7 % соответственно (рис. 8).

Далее был исследован фракционный состав ферментолизата методом молекулярно-массового распределения пептидно-аминокислотных фракций (рис. 9, табл. 3).

Таблица 2

Расчет содержания микроэлементов в ферментолизате дрожжей согласно МР 2.3.1.0253-21

Calculation of trace elements content in yeast fermentolysate according to MR 2.3.1.0253-21

Образец	Железо, мг/100 г	Удовлетворение суточной потребности, г	Медь, мг/100г	Удовлетворение суточной потребности, г
Ферментолизат дрожжей Saccha-romyces cerevisiae Y-581c	96,5	19,3	41,1	41,1

Таблица 3

Результаты хроматографического анализа биомассы и ферментолизата дрожжей Resultsofchromatographicanalysisofyeastbiomassandfermentolysate

Номер образца	Образец	мг	Мл H 2 O	D260	D280
1	Биомасса дрожжей Saccharomyces cerevisiae , обогащенная железом и медью (4,78 мг Fe/1 г С.В. дрожжей; 0,25 мг Cu/1 г С.В. дрожжей)	499	2,49	25,2	19,3
2	Ферментолизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae , обогащенный железом и медью (3,05 мг Fe/1 г С.В. дрожжей; 0,06 мг Cu/1 г С.В. дрожжей)	200	2,0	9,7	5,6

■ Пептиды (менее 1 кДа)

Рис. 8. Изменение биохимического состава биомассы дрожжей S. cerevisiaеY-581с в результате ферментолиза: АК ‒ аминокислоты; Mr ‒ молекулярная масса

Changes in the biochemical composition of yeast S. serevisiae Y-581c biomass as a result of fermentolysis: AК – amino acids; Mr – molecular weight

Из представленных в таблице 3 данных установлено, что при длинах волн 260 и 280 нм количество нуклеиновых кислот заметно сни- жается, что подтверждает факт расщепления до нуклеотидов, низкомолекулярных пептидов и аминокислот.

Рис. 9. Хроматограмма фракционного состава ферментолизата дрожжей с железом и медью. По оси абсцисс – молекулярная масса, кДа; по оси ординат – оптическая плотность при 280 нм Chromatogram of fractional composition of yeast fermentolysate with iron and copper.

On the abscissa, molecular weight, kDa; on the ordinate, optical density at 280 nm

В результате молекулярно-массового распределения фракций установлено, что основная часть микроэлементов распределена в области низкомолекулярных соединений ферментолиза-та дрожжей, что позволяет предполагать их «встраивание» в клеточную структуру и в даль- нейшем исследования направить на количественное содержание микроэлемента (см. рис. 9).

На основании полученных результатов исследований разработана блок-схема получения ферментолизата дрожжей Saccharomyces cere-visiae Y-581c (рис. 10).

Рис. 10. Блок-схема получения обогащенного ферментолизата дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-581c

Block diagram of preparation of enriched fermentolysate of yeast Saccharomyces cerevisiae Y-581c

Штамм дрожжей культивируют при температуре 28–30 °С в условиях ферментационной установки в течение 20 ч. Затем полученную дрожжевую биомассу подвергают 1-й стадии ферментной обработки при температуре 50 °С в течение 4 ч, затем протеолизу при температуре 35 °С в течение 12 ч. Полученный ферментоли-зат подвергают сепарированию с отделением жидкой фракции, а в твердую фракцию добавляют соли железа, меди и марганца в подобранной концентрации. По окончании процесса обогащения полученный ферментолизат пастеризуют при температуре 85–95 °С в течение 15– 20 мин. После охлаждения до 35–37 °С его направляют на сушку. Для получения сухого фер-ментолизата применяют распылительные сушилки или сушильные агрегаты, снабженные циклонами. Температура теплоносителя на входе составляет 160–165 °С, на выходе – 65 °С.

Заключение . Проведены сравнительные исследования способов фортификации отобранного штамма S. cerevisiae Y-581 с, подтвердившие практическую возможность сочетанного обогащения дрожжей железом и медью: 1 – при культивировании дрожжей; 2 – ферментолиза-тов инактивированных клеток, с получением обогащенной продукции с различными функционально-технологическими свойствами и целевыми направлениями их применения.

Установлены рациональные дозировки внесения микроэлементов в питательные среды для культивирования отобранного штамма (50 мг железа, 2,5 мг меди и 5,0 мг марганца на 100 см3), позволяющие достичь процент встраивания: железа – 90,7 и меди – 72,5, и повышение уровня синтеза белка на 15,5 %.

Выявлена положительная динамика повышения степени обогащения микроэлементами при фортификации ферментолизатов инактивированных дрожжей и установлены рациональные условия, обеспечивающие наибольший уровень содержания микроэлементов (Fe + Cu) в целевой продукции.

Результаты фракционного состава фермен-толизата дрожжей подтвердили существенное повышение содержания в биодоступной форме свободных аминокислот, низкомолекулярных пептидов и растворимых углеводов.

Разработана принципиальная блок-схема по получению ферментолизата дрожжевого с железом и медью.