Биостимулирующее влияние синтетических гуминоподобных веществ на ранние стадии роста Cucumis sativus L. по данным ИК-Фурье спектроскопии

Введение. В настоящее время биостимулирующие свойства гуминовых кислот и гуминопо-добных веществ вызывают существенный интерес в области биохимии растений, при этом природа их действия на различных уровнях организации вещества изучена недостаточно. Достоверно установлено ауксиноподобное действие гуминовых веществ, связанное с освобождением гидрофильных компонентов их структуры, стимуляция роста корней растений обусловлена требованием наличия определенных кислород- и азотсодержащих функциональных групп [1]. Предложена и обоснована концепция адсорбционного связывания гуминовыми веществами ингибиторов развития семян, при этом показано, что биологическая активность гуматов обусловлена структурной организацией их первичных частиц [2].

Применение природных гуматов в качестве регуляторов роста связано с рядом ограничений, в частности c сохранением ими природного генезиса, низкой растворимостью в воде, узким интервалом действующих концентраций, недостаточной биологической активностью [3], а так- же длительностью и трудоемкостью выделения препаратов из природного сырья, что предполагает актуальность разработки синтетических рострегулирующих составов, в том числе на основе продуктов сахар-аминных реакций [4].

Ранее нами были описан метод получения высокомолекулярных продуктов реакции Майяра (меланоидинов) в системе D -глюкоза – п -аминобензойная кислота [5], изучен структурногрупповой состав [6], при этом исследование природы их действия на процессы развития тест-растений ( Cucumis Sativus L.) проведено не было. Другие авторы, изучавшие ростовые процессы корней огурца на ранних стадиях в присутствии гуминовых веществ и других регуляторов роста, не исследовали данную проблему [7], полезную информацию для решения которой можно получить с применением современных вариантов методов колебательной спектроскопии [8–10].

Цель исследования: ИК-Фурье спектроскопическое исследование динамики процессов образования первичных метаболитов в корневой системе проростков тест-растений Cucumis Sativus L., происходящих при их проращивании в растворах синтетических гуминоподобных продуктов.

В соответствии с поставленной целью решались задачи синтеза гуминоподобных продуктов на основе D -глюкозы и п -аминобензойной кислоты, проведения вегетационных экспериментов на тест-растениях ( Cucumis Sativus L.) с добавками синтезированных продуктов и анализ ИК-Фурье спектров проростков посредством отнесения основных полос, характеризующих изменение содержания первичных метаболитов в корневой системе растений.

Материалы и методы исследования. Синтез целевых продуктов проводили в течение 2 ч по ранее предложенной методике [5], модифицированной использованием в качестве растворителя абсолютированного этанола фирмы Merck. По окончании синтеза после удаления избытка растворителя твердый остаток промывался дистиллированной водой на стеклянных фильтрах до исчезновения поглощения фильтрата при длине волны 465 нм. Водорастворимая фракция (проба фильтрата объемом 25 мл) подвергалась диализу через целлофановые мембраны (10-кратный объем чистого растворителя (воды)) в течение 24 ч и использовалась в исходном и разбавленном до требуемой концентрации виде для биотестирования. Концентрации растворов предварительно установлены гравиметрически.

Продукты недиализуемой водорастворимой фракции выделялись в твердом виде в форме порошков коричневого цвета для контроля структурно-группового состава методом ИК-Фурье спектроскопии. Спектры снимались в режиме пропускания в таблетках KBr (Fluka, 1 : 200) на ИК-Фурье спектрометре ФСМ 2201 («Инфраспек», Санкт-Петербург, Россия) в интервале волновых чисел 4000–500 см-1 со спектральным разрешением по волновому числу 4 см-1 при 60 сканах относительно воздуха, интенсивность полос определялась по методу базовой линии. Кратность измерений составляла не менее трех экспериментов.

Биотестирование полученных препаратов проводилось с использованием в качестве тест-растений семян огурца сорта Нежинский в трех параллелях. В чашки Петри, выложенные фильтровальной бумагой, полностью смоченной рабочими растворами, выкладывали по 10 семян и помещали в термостат. После четырех суток инкубации при 20 °С оценивалось количество нормально проросших семян и изменение длины корней в сравнении с контрольной пробой (дистиллированная вода). Для изучения характера действия синтезированных продуктов на ростовые процессы пробы (2 мг) корни проростков биотестируемых образцов семян высушивались, измельчались до однородной массы, таблетировались с KBr (1 : 300) и также исследовались ИК-Фурье спектроскопически [10].

Результаты исследования и их обсуждение. Проведенное ранее изучение структурногруппового состава синтезированных водорастворимых недиализуемых продуктов показывает их близость к природным гуминовым веществам [6], что предполагает сходство в характере их биоактивности в лабораторных и вегетационных экспериментах. В данном исследовании по ИК-Фурье спектрам поглощения дополнительно проведена оценка индекса гидрофобности (HI) как отношения значения интегрального поглощения в областях 3000–2800 см^-1 (гидрофобная составляющая) к аналогичному значению в интервале 1720–1600 см^-1 (гидрофильная составляющая) [11–13]. Рассчитанное значение HI составило 1,18±0,02, что сопоставимо со значениями того же параметра, оцененного авторами [12] для различных по составу природных гуминовых веществ. Последнее имеет важное значение для сопоставления структурных параметров с эффектами изменения ростовых показателей.

Данные таблицы показывают, что с уменьшением содержания активного вещества в растворе ростстимулирующее действие возрастает.

Влияние растворов синтезированных продуктов на ростовые характеристики семян огурца сорта Нежинский

Данный эффект является установленным для действия растворов природных гуминовых веществ на ростовые процессы [1, 14], что позволяет считать синтезированные продукты гуминопо-добными и по характеру биологической активности.

Механизмы влияния синтетических регуляторов роста на развитие растений, как уже указыва- лось, сложны и недостаточно изучены, тем не менее некоторую информацию о процессах роста могут также дать спектральные методы [5, 9, 11]. Спектры образцов корней тест-растения после вегетационных экспериментов приведены на рисунке.

Фрагменты ИК-Фурье спектров в диапазоне 1800–600 см-1 корней проростков: 1 – контроль; 2 – после обработки раствором с концентрацией 0,008 %; 3 – после обработки раствором с концентрацией 0,004 %; 4 – после обработки раствором с концентрацией 0,002 %

Присутствие сложноэфирных фрагментов (пектиновые полисахариды и липиды клеток) подтверждается наличием полосы 1735 см-1 (νС=О), полоса 1 165 см-1 может быть отнесена к колебаниям гликозидных фрагментов полисахаридов (νasC-O-C). Белковая составляющая структуры представлена полосами амид I и амид II в интервале 1520–1650 см-1 (νC=O, δNH + νCN); эта же область отвечает колебаниям ионизированных кислотных групп пектина (νasСОО-) и ароматических лигниновых систем (νC=C) [11]. Широкая полоса в интервале 1460–1380 см-1 характерна для алифатических и алициклических лигнина и полисахаридов (δСН), а также функциональных групп пектина (δОН, νsСОО-). Размытый сигнал при 1240 см-1 относится к асимметричным валентным колебаниям Р=О (νasPO2-) нуклеиновых кислот с вкладом полос амид III (νCN) и νС-О карбоксильных групп, тогда как 1107 см-1 – к колебаниям νСО + νСС связей пектинов [9, 11]. Со- ставная полоса в области 1000–1100 см-1, характеризующая наличие фрагментов гемицеллюлоз и нуклеотидов (νССO + νСО + νCC +δОСН, νsРO2-), имеет на низкочастотном крыле плечо 980–1000 см-1, относимое к колебаниям Р-О в Р(=О)ОН и РОН фрагментах [15]. Полосы в области ниже 950 см-1 малоинтенсивны и отвечают деформационным колебаниям С-Н в ароматических структурах (γ=С-Н), а также скелетным колебаниям углеводных колец.

Сопоставление спектров 3 и 4 со спектром контрольного опыта 1 показывает увеличение интенсивности ряда полос. В частности, с уменьшением концентрации растворов и усилением стимуляции роста увеличивается интенсивность карбонильной полосы 1735 см-1, связанная с аккумуляцией пектинов клеточных стенок [8]. Также начинает отчетливо проявляться полоса при 1325 см-1, относимая к сложным колебаниям циклических углеводных фрагментов с вкладом νС-О [11], аналогичный эффект наблюдается для полосы около 1240 см-1. Кроме того, фиксируется увеличение интенсивности широкого сигнала в области 960–1200 см-1 с максимумом при 1067 см-1, что может быть связано с углеводной (целлюлоз-гемицеллюлозной) конверсией [11]. При этом спектр 2, отвечающий проращиванию семян в 0,008 % растворе, показывает профиль полос, практически аналогичный контрольному спектру как по положению сигналов, так и по их интенсивности (интенсивность полосы в области 1600–1650 см-1 оказывается даже ниже контроля). Подобные изменения согласуются с данными экспериментов по проращиванию (см. табл.), когда для 0,004 и 0,002 % растворов наблюдается рост, тогда как для 0,008 % – угнетение. Можно предположить, что увеличение интенсивности ИК-полос связано с образованием соответствующих веществ [10], в частности процессами биосинтеза фосфорорганических соединений, что характерно для действия природных гуматов и стимуляции образования углеводов [1].

Выводы. Лабораторные эксперименты по проращиванию семян тест-растения сорта Нежинский в растворах синтезированных продуктов показывают увеличение их ростстимули-рующей активности с уменьшением концентрации, что указывает на гуминоподобную природу их биоактивности. Анализ ИК-Фурье спектров корней проростков свидетельствует об активации процессов синтеза фосфорорганических соединений и увеличения углеводного пула на ранних стадиях роста. Исследованные продукты синтезируются из доступных и экологически безопасных биологически активных веществ ( D -глюкоза, п -аминобензойной кислота), что в совокупности с их ростактивирующим действием и простотой получения делает перспективным дальнейшее изучение механизмов действия данных соединений на растительные системы с целью создания на их основе технологии производства эффективных и экологичных препаратов для растениеводства.