Биотехнологическая программа в форме БАД для поддержки индигенной микрофлоры кишечника

Достижения современной биотехнологии и нутрициологии убедительно свидетельствуют о значении микробиома в процессах жизнедеятельности, возможности использования биотехнологических продуктов в виде про-, пре- и метабиотикотерапии для профилактики и комплексного лечения дисфункции желчных путей, кишечных инфекций различной этиологии, дисбактериоза и других распространенных заболеваний желудочнокишечного тракта [1-3].

В симбиозе с организмом человека сформировался значительный объем индивидуального штаммового пейзажа микробиоты ки- шечника, где количество клеток микроорганизмов составляет сто биллионов (1014), что в 100 раз превышает уровень собственных клеток человека.

Микрофлора кишечника прямо или косвенно участвует во всех биохимических процессах и функциях организма, являясь главным биогенным фактором, определяющим здоровье и развитие возможных патологий. Последнее особенно актуально в настоящее время, когда микробиота человека подвергается агрессивному воздействию многочисленных факторов внутренней и внешней среды: глобальные изменения климата, ксенобиотики, нарушения питания, психоэмоциональные нагрузки, распространение алиментарных и инфекционных заболеваний, неконтролируемое употребление антибиотиков, других лекарственных средств и т. д. Возникает необходимость пересмотра стратегии поддержки и восстановления индивидуальной кишечной микрофлоры при помощи пробиотикотера-пии. Показано, что выживаемость пробиотических микроорганизмов при их транзите через желудочно-кишечный тракт составляет всего 0,00000008 %. Неэффективность пробиотических препаратов связывают также с чужеродностью их штаммов, выращенных на искусственных средах, что не соответствует высокой индивидуальной специфичности собственной (индигенной) микрофлоры. Немаловажное значение имеет сформировавшийся клеточный иммунитет биопленки кишечника, который не пропускает чужеродные пробиотики без наличия соответствующего «пароля» и они, не выполнив своих функций, покидают кишечник транзитным путем [4]. Однако имеются случаи, когда барьерная функция эпителия нарушается и чужеродные пробиотические препараты инициируют транслокацию кишечных микроорганизмов и их токсинов в несвойственный им биотоп-кровоток и брюшную полость, вызывая летальный исход от развития инфекционнотоксического шока, перитонита и бактериемии [5–8]. Вместе с тем, индигенные пробиотические микроорганизмы обладают способностью продуцировать экзометаболиты, эффективно восстанавливающие нормальную микробиоту кишечника при дисбиотических состояниях.

Перспективным способом коррекции, профилактики и регуляции кишечного микробиоценоза является использование пребиоти-ков, которые, имея немикробное происхождение, оказывают селективную стимуляцию роста и активизацию нормальной микрофлоры, при этом сами не участвуют в обменных процессах организма. К этой группе относятся пищевые волокна (целлюлоза, инулин, гемицеллюлоза, пектины), олигосахариды различного происхождения, поли- и олигофруктаны, другие многочисленные вещества и соединения природного происхождения или, полученные путем биотехнологического и химического синтеза. Пребиотики являются источниками доступных микрофлоре углеводов в качестве основного питательного материала. При ферментативном распаде инулина, дру- гих пребиотиков образуются короткоцепочечные жирные кислоты, снабжающие микробиоту кишечника энергией, и, защищающие его от воспалительных процессов.

Начинают активно применяться синбио-тики (различные комбинации про- и пребио-тиков), а также микробные метаболиты (метабиотики), клиническая эффективность которых в коррекции микроэкологических нарушений имеет доказательные материалы [9, 10].

Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали живые микрокапсулированные формы пробиотиков (бифидо- и лактобактерий), пребиотики и производственные образцы БАД, представляющие биотехнологическую программу коррекции индигенной микрофлоры кишечника.

Применяли общедоступные и специальные методы испытаний качества и безопасности БАД, согласно требованиям нормативных документов к этой группе специализированных продуктов.

Микробиологические показатели: бифидобактерии, лактобактерии, дрожжи и плесени определяли по ГОСТ 10444.11-2013, БГКП (колиформы) - ГОСТ 31747-2012, патогенные, в том числе сальмонеллы - ГОСТ 316592012, Staphylococcus aureus - гептахлор, ГХЦГ и ДДТ (сумма изомеров) - ГОСТ 30349-96, кадмий и свинец - ГОСТ 30178-96, ртуть - ГОСТ 53183-2008, мышьяк - ГОСТ 51766-2001.

К физико-химическим показателям относятся: содержание в-глюканов и средняя масса капсулы.

в-глюканы - полисахариды, структуру которых составляют молекулы глюкозы, соединенные между собой Р-(1^3)-, Р-(1^6) связями.

Метод определения в-глюканов в специализированных продуктах микробиологического происхождения основан на их ферментативном гидролизе с использованием в-глюкозидазы (глюкан-1,3-в-глюкозидазы) и а-глюкозидазы (глюкан-1,4-а-глюкозидазы). Продукт ферментативного гидролиза определяют колориметрическим методом по степени окраски глюкозы (ГОСТ Р 57513-2017).

Результаты и их обсуждение

Разработана новая форма БАД, представляющая биотехнологическую программу для формирования и поддержки собственной ки- шечной микрофлоры. Для обоснования качественного и количественного состава БАД дана характеристика рецептурных ингредиентов, исходя из имеющихся данных по их использованию в экспериментальной и клинической практике.

В качестве пробиотиков используются живые микрокапсулированные бифидо- и лактобактерии. Пребиотиками, обеспечивающими рост и жизнеспособность пробиотиков, служат фибригам, лактулоза и бета-глюкан.

Сухие селективные биомассы бактерий:

– Bifidobacterium bifidum – применяется в качестве стартовой культуры. Генетической особенностью штамма является устойчивость к антибиотикам, стрептомицину, мономици-ну, зентамицину и канамицину. Обладает ан-тагонитической активностью по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам, ши-геллам Зонне и Флекснера;

– Hactobacillus casei – получена из итальянского сыра, характеризуется высокой жизнедеятельностью при хранении. Используется в качестве закваски для ферментирования кисломолочной продукции. Нормализует кишечную микрофлору;

– Bifidobacterium infantis – выделена из кишечника здорового ребенка первого года жизни. Хороший кислотообразователь, ингибирует условно-патогенные микроорганизмы, обладает устойчивостью к ряду антибиотиков, желудочному соку и желчи, нормализует микрофлору желудочно-кишечного тракта. Снижает продукцию эндотоксинов, которые высвобождаются при распаде (лизисе) бактериальной клетки, попадают в кровоток и вызывают метаболическую эндотоксемию. Последняя приводит к системному воспалению кишечника, провоцирует развитие других заболеваний;

– Hactobacillus rhamnosus – используют как пробиотик; штамм вырабатывает молочную кислоту, обладает большой авидностью для клеток кишечника; устойчив к кислотам и щелочам;

– Hactobacillus acidophilis – сбраживает маннит, глюкозу, мальтозу, лактозу и сахарозу, применяется в технологии детских кисломолочных продуктов. В отличие от известных ацидофильных штаммов обладает высокой протеолетической активностью, не подвержена фагам, имеет низкий предел кислотообра-зования (предельная кислотность штамма – 50 °Т). Угнетает стафилококки, энтерококки, споровые формы бактерий, нормализует кишечную микрофлору;

– Bifidobacterium longum – положительные свойства проявляются в способности регулировать дифференцированное образование противовоспалительных цитотоксинов и Т-хелиеров Th2. Формирует гуморальный иммунный ответ путем активации В-лимфоцитов и индуцирования Th2-цитотоксина IL-10. Этот эффект осуществляется живыми микробными клетками в виде фильтратов, а также их структурными компонентами – ДНК, пептидогликанами и липотейхоевой кислотой;

– Bifidobacterium breve – выделен из влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста. Новорожденные приобретают данный вид флоры от матери, проходя по родовым путям. Активно подавляет рост условнопатогенных микроорганизмов – Pseudomonas aeruginosa , Escherichia coli , Streptococcus faecalis , Klebsiella ozaenae и Streptococcus aureus , повышает содержание лактобацилл и бифидобактерий, обеспечивая, тем самым, коррекцию дисбиотических нарушений микробиоты, доминирующее положение молочнокислых бактерий и позитивные изменения микрофлоры в целом.

• –    Инулин. Относится к группе пищевых волокон (полисахаридов). Не переваривается пищеварительными ферментами, выполняя функцию пребиотика;

• –    Бета-глюкан – обладает эффективными иммуномодулирующими свойствами. Необходим при различных заболеваниях и патологических состояниях организма, обладает противоопухолевым и радиопротекторным эффектами;

• –    Фибригам В – экссудат пищевых волокон, получаемых из смолы акации (heguminosae).

Пребиотик лактулоза – вещество с пре-биотическими свойствами. Ингибирует образование потенциально патогенных бактерий, активизирует рост полезных микроорганизмов (лакто-, бифидобактерий и др.), обеспечивая благоприятный баланс кишечной микрофлоры. Лактулоза в неизменном виде доходит до толстой кишки и метаболизируется ее бактериями. Продукты метаболизма сдвигают рН среды в кислую сторону, которая губительно действует на развитие патогенной микрофлоры.

Ультрализаты пептидные – продукты расщепления пробиотических бактериальных клеток на фрагменты клеточной стенки бактерий и их внутриклеточного содержимого. Ультрализат пептидный Propinibacterium freudereichii – пробиотик выделенный из швейцарского сыра, используется для защиты сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов от микробной порчи. Является продуцентом уксусной, пропионовой кислот и цианокабаламина (витамина В12). Ультрализат пептидный Propinibacterium arabinosum – продуцент трегалозы, пропионовой кислоты и цианокабаламина. Пропионовая кислота осуществляет блокировку адгезии патогенов к эпителию кишечника, регуляцию его пролиферации и дифференцировки с обеспечением энергии. Поставляет субстраты для глюконеогенеза, поддерживает ионный обмен, обладает антибактериальным эффектом, снижает содержание насыщенных жирных кислот в плазме крови и печени, повышает чувствительность к инсулину. Витамин В12 обладает высокой биологической активностью входя в состав многочисленных ферментов в качестве кофактора, принимает участие в процессах созревания эритроцитов и кроветворения, снижает концентрацию «вредного» холестерина в крови, является необходимым компонентом биосинтеза нуклеиновых кислот и функционирования нервной системы. Трегалоза выполняет защитную внутриклеточную роль при стрессе, возникающем при воздействии на организм многочисленных факторов внутренней и внешней среды.

Из вспомогательных веществ важное значение имеют тиамин (витамин В 1 ) и пиридоксин (витамин В₆). Выполняя функцию коферментов, они участвуют в многочисленных обменных процессах организма, необходимы для нормального роста и развития кишечной микрофлоры.

Разработан рецептурный состав биотехнологической программы в виде капсулированной формы БАД, компоненты которой обладают синергическими свойствами в отношении поддержки индигенной микрофлоры кишечника (табл. 1).

Вспомогательные вещества: тальк (агент антислеживающий) – 12, кальция стеарат

Таблица 1

Рецептура биологически активной добавки

Наименование компонентов	Содержание, мг/1 капсуле	Наименование компонентов	Содержание, мг/1 капсуле
Биомасса бактерий селективная сухая BB-Bf серии «Панбиом» («Panbiom») Bifidobacterium bifidum	60	Биомасса бактерий селективная сухая BB-Br серии «Панбиом» («Panbiom») Bifidobacterium breve	30
Биомасса бактерий селективная сухая LB-Cs серии «Панбиом» («Panbiom») Lactobacillus casei	60	Инулин Фибрулин Инстант Инулин	13,897
Биомасса бактерий селективная сухая Bifidobacterium infantis	50	Бета-глюкан, 75 % Бета-глюкан	20 15
Биомасса бактерий селективная сухая LB-Rm серии «Панбиом» («Panbiom») Lactobacillus rhamnosus	50	Фибригам В	5
Биомасса бактерий селективная сухая LB-Ac серии «Панбиом» («Panbiom») Lactobacillus acidophilus	50	Лактулоза полуфабрикат	5
Биомасса бактерий селективная сухая BB-Ln серии«Панбиом» («Panbiom») Bifidobacterium longum	30	Ультрализат пептидный PR- Frd Propionibacterium freudenreichii	3
Ультрализат пептидный PR- Propionibacterium arabinosum	3

Таблица 2

Регламентируемые показатели качества БАД

Наименование показателя	Содержание характеристики
Внешний вид	Желатиновая капсула
Цвет содержимого капсулы	Порошок от белого до кремового цвета, допустимы вкрапления
Запах и вкус	Специфический
Средняя масса капсулы, мг	476 (428-523)
Содержание β-глюканов, мг/1 капсуле	15 (12-18)

Таблица 3

Санитарно-гигиенические показатели БАД

Наименование показателя		Значение показателя
		допустимый уровень	фактическое содержание
Дрожжи, КОЕ/г, не более		100	менее 10
Плесени, КОЕ/г, не более		100	менее 10
Масса продукта, г, в которой не допускаются:	E. Coli	1,0	не обнаружены
	Staphylococcus aureus	2,0	не обнаружены
	Патогенные в т. ч. сальмонеллы	10,0	не обнаружены
	БГКП (колиформы)	0,1	не обнаружены

Таблица 4

Санитарно-токсикологические показатели БАД

Наименование показателя		Допустимый уровень, мг/кг, не более
		допустимый уровень	фактическое содержание
Токсичные элементы	Свинец	0,1	0,62
	Мышьяк	0,05	0,04
	Кадмий	0,03	менее 0,01
	Ртуть	0,005	менее 0,001
Пестициды	ГХЦГ (сумма изомеров)	0,05	менее 0,005
	ДДТ и его метаболиты	0,05	менее 0,05
	Гептахлор	не допускается (<0,002)	менее 0,002
	Алдрин	не допускается (<0,002)	менее 0,002

// Инфекционные болезни. – 2016. – Т. 14, № 3. – С. 37–48.

• 5.    M.G.H. Besselink, H.C. van Santvoort, E. Buskens, M.A. Boermeesteret al. Probiotic propnulaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 2008; 371: 651–659.

• 6.    B.U. Rudwan, C.J.M. Koning, M.G.H. Besselink, H.M. Timmermanet al. Antimicrobial activity of a multispecies probiotic (Ecologic 641) against pathogens isolated from infected pancreatic necrosis. Lettersin Applied microbiology. 2008. 46. 61–67.

• 7.    Роль пробиотических микроорганизмов в транслокации кишечной микробиоты в брюшную полость и кровоток экспериментальных животных / И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский, И.А. Лундовских и др. // Инфекционные болезни. – 2015. – Т. 13, № 4. – С. 43–52.

• 8.    Транслокация кишечной микробиоты / И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский, И.А. Лун-довских и др. // Журнал международной медицины. – 2016. – № 2 (19). – С. 24–31.

• 9.    Сателлитный симпозиум. Коррекция и профилактика дисбактериоза. Новые подходы к терапии заболеваний желудочнокишечной системы / под ред. Н.А. Токаревой // Эффект. Фармакотерапия. Гастроэнтерология. – 2011. – № 3. – С. 77–84.

• 10.    Чичерин, И.Ю. Сравнительная экспериментальная оценка эффективности современных пробиотиков, пребиотиков, синбио-тиков и метабиотиков при коррекции нарушения бикробиоценоза кишечника у животных с антибиотико-ассоциированном дисбио-зом животных / И.Ю. Чичерин // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2016. – № 7(131). – С. 106–120.