Четырехклассная систематизация биокриоконсервантов. I класс хладоограждающих растворов - эндоцеллюлярные криоконсерванты.

Введение. Трансфузионная криобиология — сравнительно молодая, динамично развивающаяся наука, но уже широко используемая специалистами экономически развитых стран. Арсенал ее методов и средств неуклонно совершенствуется и обновляется. Отмеченное выше относится к труду проф. Е. П. Сведенцова «Криоконсерванты для живых клеток» [1]. Автор впервые систематизировал известные сложные хладоограждающие растворы, а также еще создающиеся новые композиции биокриоконсервантов по свойствам и числу входящих в их состав криопротекторов с «реставрирующими» добавками в единую четырехклассную систему. Труд известного Российского ученого оказался весьма актуальным и, судя по поступающим просьбам повторить тираж его издания, необходимым для научных работников и практических врачей в области криобиологии и криомедицины.

Целью настоящей работы является попытка ознакомить широкий круг научных сотрудников и практических врачей, выпол- няющих исследования в области экспериментальной и клинической трансфузионной криобиологии, с современной четырехклассной систематизацией биокриоконсервантов для замораживания клеток крови и костного мозга.

• 1.    Первый класс хладоограждающих растворов.

Включает сильные биоэндокриоконсер-ванты (проникающие через плазматическую мембрану в клетки животных и человека) на основе глицерина, диметилацетамида (ДМАЦ), диметилсульфоксида (ДМСО) и их сочетаний.

Глицерин — С₃Н₈О₃ — трехатомный спирт м. м. 92,10. Благодаря наличию ОН-групп, образует водородные связи с молекулами воды растворяется в ней в любых пропорциях. Глицерин растворяет соли и щелочи, мочевину, сахарозу и газы, а также растворяется в метиловом,этиловом и пропиловом спир-тах.Он тропен к клеткам и тканям организма животных.Участвует в энергетическом обмене. Глицерин — вещество с выраженной токсичностью. Его ЛД ₅ составляет 4,57±0,14 г/кг [2].

В составе криоконсерванта используется глицерин (Glycerol) высшей степени (в/с) очистки или высшего сорта (ГОСТ 6259–75) с относительной плотностью 1,248. Утвержден Фармакологическим комитетом Минздрава и социального развития РФ для консервирования компонентов донорской крови (КДК) и ядерных клеток костного мозга (ЯККМ) и пуповинной крови (ПК) при температурах –10о÷-196оС. Криопротекторная активность глицерина высока на различных биологических объектах [3].

• 1.1.    Моноэндоцеллюлярные криоконсерванты на основе глицерина для быстрого замораживания эритроцитов при –196^оС.

До настоящего времени криоконсерванты этого класса остаются лучшими для замораживания эритроцитной взвеси (ЭВ) [1]. Для быстрого замораживания ЭВ при –196^оС в жидком азоте разработан криоконсервант ЦНИИГПК 11₄ , в котором концентрация глицерина составляет 30 %: Глицерин в/с, 300 мл; Маннит, 40 г; NaCl, 7 г или ЭДТА Na₂ 3 г

Na2HPO4•12H2O, 0,3 г; Вода бидистиллирован-ная — до 1000 мл; рН 5,6–6,2.

Криоконсервант добавляют к эритроцит-ной массе (ЭМ), помешивая в течение 5–8 мин в соотношении 1 : 1, приготовленную ЭВ оставляют при комнатной температуре на 15–20 мин для глицеринизации, затем переводят в криоконтейнер, герметизируют и погружают в жидкий азот на 2 мин [1, 4]. В жидком азоте эритроциты хранят до 10 лет. Оттаивание замороженных эритроцитов в криоконтейнере производят в водяной ванне при + 45оС в течение 26 сек при ритмичном покачивании криоконтейнера в режиме 200 качаний в минуту. Последующее отмывание глицерина от эритроцитов производят растворами хлорида натрия,маннита или сахарозы до нормотонической концентрации этих растворов. Затем ЭВ центрифугируют осадок эритроцитов ресуспендируют в плазмозамещающем растворе ЦОЛИПК № 8-в, переводят в полимерные контейнеры «Гемакон 300» или «Компопласт 300», герметизируют паспортизируют и транспортируют в клинику.

Разработан метод консервирования эритроцитов при –25^оС, —38^оС со сниженной концентрацией глицерина: разработаны растворы ЦНИИГПК 11_5-м и ЦНИИГПК _5-с. Концентрация глицерина в них составляет 40 %.

Состав криоконсерванта ЦНИИГПК 11_5-м : Глицерин в/с, 400 мл; Маннит, 40 г; NaCl, 7 г Na₂HPO₄•12H₂O, 0,3 г; Вода бидистиллирован-ная — до 1000 мл.

Состав криоконсерванта ЦНИИГПК 11_5-с : Глицерин в/с, 400 мл; Сахароза, 50 г; NaCl, 7 г Na₂HPO₄•12H₂O, 0,3 г; Вода бидистиллирован-ная — до 1000 мл.

Криоконсерванты медленно добавляют к ЭМ в соотношении 1:1 при постоянном помешивании ЭВ, затем центрифугируют при 1100 g 20 мин при + 4оС, удаляют надосадочную жидкость, осадок эритроцитов перемешивают, ЭВ переводят в криоконтейнер, герметизируют и замораживают в жидком азоте в течение 2–2,5 мин. Срок максимального хранения эритроцитов в замороженном виде составляет 10 лет, после чего эритроциты размораживают, отмывают от криопротектора, взвешивают в растворе ЦОЛИПК № 8-в по стандартной технологии, переводят в полимерные контейнеры «Гемакон 300» или «Компопласт 300», герметизируют, паспортизируют и транспортируют в клинику.

• 1.2.    Моноэндоцеллюлярные криоконсерванты на основе глицерина для замораживания эритроцитов по методам Американской ассоциации банков крови (ааВВ).

Американской ассоциацией банков крови (ааBB) для консервирования эритроцитов замораживанием применяется глицерин в низкой (около 20 %) или высокой (около 40 %) конечной концентрации [1] . Технология с низкой концентрацией глицерина позволяет использовать биохранилища с жидким азотом (–196^оС), а с высокой конечной концентрацией криопротектора — электроморозильники на –80^оС. Эритроциты, консервированные с растворами AS-1(СРD) и AS-3 (CP2D), могут успешно замораживаться даже после 42 дней хранения в указанных консервантах. Отмечен опыт успешного переливания размороженных эритроцитов, хранившихся 21 год при –196^оС [6].

Состав AS-1: Глюкоза, 11,1 г; Аденин, 0,21 г; Манитол, 4,1 г; Натрия хлорид, 15,4 г.; Объем до 100 мл.

Состав AS-3: Глюкоза, 5,5 г; Аденин, 0,22 г Натрия хлорид, 7,0 г.; Na₂HPO₄, 1,9 г; Na₃ цитрат, 1,9; Лимонная кислота, 0,2. Объем до 100 мл.

• 1.2.1.    Моноэндоцеллюлярный криоконсервант для медленного замораживания эритроцитов с гдицерином в воздушной камере электроморозильников от –60^оС до –80^оС.

Разработан Г. С. Воробьевой и Ф. Р. Виноград-Финкель [1]. В состав крироконсерван-та входят: Глицерин в/c, 570 мл; Маннит, 20 г; Натрия хлорид, 4 г; Na₂HPO4•12H₂O, 0,8 г Вода для инъекций — до 1000 мл.

Конечная концентрация глицерина в суспензии эритроцитов составляет 40 %. Вся технология криоконсервирования и де-глицеринизации эритроцитов растворами с трехкратно понижающейся осмолярностью проводится в одном контейнере «Гемакон 500». КДК хранят полноценными при –80оС до 4 лет.

Высокая концентрация глицерина предусматривает глицеринизацию эритроцитов в течение 4 часов. Медленное замораживание клеток в электроморозильнике до –80оС допускает их длительное хранение при –65оС и последующее отмывание от протектора.

• 1.2.2.    Моноэндоцеллюлярный криоконсервант для замораживания эритроцитов при –25^оС ÷ –38^оС со сниженной концентрацией глицерина.

Метод предложен В. Н. Мельниковой и со-авт. [1]. Применяется известный криоконсер-вировант ЦНИИГПК 11_5-м или ЦНИИГПК11_5-с которые смешивают с ЭМ в соотношении 1:1. Конечная концентрация глицерина в ЭВ составляет 20 %.

Пропись раствора ЦНИИГПК 11 ₅-М: Глицерин, 400 мл; Манит, 40,0 г; Натрия хлорид 7,0 г; Натрия фосфат двузамещенный, 0,3 г Вода для инъекций до 1000 мл;рН раствора 6,1–6,3. Разливают по 125 мл и 250 мл в стеклянные флаконы вместимостью 250 мл.

Для замораживания используют электроморозильники на –25оС и –38оС, которые обеспечивают сохранность КДК, соответственно от 5 до 12 мес. Перед трансфузией размороженные эритроциты отмывают в 3 растворах хлорида натрия в убывающей концентрации 3,2; 2,0 и 0,9 %.

• 1.3.    Моноэндоцеллюлярный криоконсервант для медленного замораживания и хранения эритроцитов с глицерином в электрическом морозильнике при – 30^оС

  Метод разработан Ю. С. Суханолвым и со-авт. (1987). Для замораживания и хранения ЭВ с глицерином в электрическом морозильнике при –30^оС применяют криоконсерванты ЦНИИГПК 11_5–55 и ЦНИИГПК 11_5-c[ 1 ] .

Состав ЦНИИГПК 11_5–55 : Глицерин в/с, 550 мл; Маннит, 40 г или Сахароза, 50 мл; Натрия хлорид, 7 г; Натрия фосфат двузамещенный 0,3 г; Вода для инъекций — до 1000 мл; рН раствора 5,8–6,3 (с сахарозой).

Состав ЦНИИГПК 11₅-_с : Глицерин в/с, 400 мл; Маннит, 40 г или Сахароза, 50 мл; Натрия хлорид, 7 г; Натрия фосфат двузамещенный 0,3 г; Вода для инъекций — до 1000 мл; рН раствора 6,0–6,75 (с Маннитом).

Отмеченные криоконсерванты смешивают в течение 10 мин с ЭМ в контейнере из поливинилхлорида (ПХВ) в соотношении 1:1 или 1,6:1. К каждым 125 мл ЭМ добавляют 200 мл раствора и выдерживают при комнатной температуре в течение 15–20 мин. Конечная концентрация глицерина в ЭВ составляет 24,6 % и 27 %, соответственно. Размораживают в водяной ванне при темпера- туре + 38о÷ + 40оС в течение 10 мин. Деглице-ринизацию осуществляют при трехкратном серийном центрифугировании ЭВ с применением понижающихcя концентраций солевых растворов до нормотонии.Отмытые эритроциты взвешивают в ЦОЛИПК № 8-в.

К настоящему времени созданы высокоэффективные «закрытые» автоматические технологии глицеринизации и деглицерини-зации эритроцитов, позволяющие сохранять в жизнеспособном состоянии до 99 % красных кровяных телец.

• 1.4.    Моноэндоцеллюлярный криоконсервант на основе глицерина для замораживания гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) костного мозга при –70^оС.

Метод разработан А. Г. Федотенковым и со-авт. [6, 7]. Аспирируемую костно-мозговую взвесь стабилизируют консервирующим раствор ом ЦНИИГПК № 3 , состоящем из смеси № 1 и смеси № 2. Его состав:

Смесь № 1 : Сахароза, 4,3 г; Глюкоза, 0,4 г ЭДТА Na₂,0,1 г^; Вода бидистиллированная до 50 мл; рН смеси 7,0–7,2.

Смесь № 2: Натрий лимоннокислый трехзамещенный, 1 г; 10 % раствор желатина, 25 мл; Вода бидистиллированная до 50 мл; рН смеси 7,0–7,2.

Смеси № 1 и № 2 расфасовывают по 100 мл в стеклянные флаконы на 250 мл и стерилизуют раздельно (для избежания карамелизации глюкозы) в течение 30 мин при 1,2 атм.Затем хранят в двойных бязевых мешках при + 4оС в течение 2-х недель.

Перед применением их сливают асептично закрытым способом в один флакон на 500 мл.

Флаконы с заготовленной на растворе ЦНИИГПК № 3 костно-мозговой взвесью ставят на 30 мин под углом 45оС при комнатной температуре.

При криоконсервировании костного мозга в растворе ЦОЛИПК-1 с добавлением 20 % раствора глицерина и катионной сыворотки сохраняется до 85 % жизнеспособных клеток. Авторы сообщают о высокой лечебной эффективности миелоидной ткани, консервированной с 15 % раствором глицерина у смертельно облученных собак.

Глицерин, обладая высокой осмолярностью и низкой скоростью диффузии через цитоплазматическую мембрану, способен вызывать осмотический гемолиз клеток в момент введения их в сосудистое русло реципиента. Поэтому перед трансфузией требуется предварительно удалять криопротектор из костномозговой суспензии [8]. Такая вынужденная процедура приводит к снижению жизнеспособности и потере значительного количества ядерных клеток.

А. Г. Федотенков и соавт. [7] для замораживания ЯККМ (ГСК) предложили криоконсервант на основе 15 % глицерина . Его состав: Глицерин в/с, 30 мл; Надосадочная жидкость, 50 мл; Сыворотка АВ (ΙV) группы крови, 20 мл.

Миелоэксфузат стабилизируют на консервирующем растворе ЦОЛИПК № 3 с 10 % раствором желатина в соотношении 1: 3–1:4 (с учетом свертываемости биосреды). Под влиянием желатина в течение 30 мин происходит четкое разделение биосреды на два слоя. Надосадочный слой обогащенный ЯККМ и ГСК, переводят в отдельный флакон, центрифугируют 15 мин со скоростью 1200 об/мин при + 5оС. Затем отделяют надосадок, обедненный ЯККМ и ГСК, для ретрансфузии донору. Оставшиеся во флаконе 100 мл биосреды, обогащенной ЯККМ и ГСК, тщательно ресу-спендируют, после чего к ней медленно добавляют криоконсервант в соотношении 1:1. Приготовленную миеловзвесь с 15 % глицерином выдерживают при комнатной температуре 30 мин (для глицеринизации ЯККМ), затем разливают в пластикатные криопакеты, герметизируют и помещают в электроморозильник на –20оС на 25 мин до момента кристаллизации (–9оС). Затем биоконтейнер переносят в электроморозильник на –70оС. Срок хранения ЯККМ и ГСК в этих условиях ограничен 2 мес. После размораживания суспензии в водяной ванне при + 39о÷ + 40оС насчитывается 76– 92 % эозинорезистентных ядерных клеток. Перед переливанием реципиенту клетки отмывают от глицерина растворами с понижающимися концентрациями глюкозы или сахарозы. Конечная концентрация глицерина в суспензии ЯККМ составляет 3,3 %. Морфологическая сохранность и пролиферативная активность ГСК наиболее высоки через 10–15 мин после отогревания и де-глицеринизации клеточной суспензии.

• 1.5.    Моноэндоцеллюлярный криоконсервант «Пропандиосахароль» на основе пропиленгликоля (1,2 ПД) для замораживания эритроцитов при –196^оС.

Пропиленгликоль — С3Н8О2 — двухатомный спирт алифатического ряда, м. м. 76,1 смешивается с водой в любых пропорциях его эндоосмос в эритроциты проходит быстрее, чем у глицерина. Функциональные группы — «ОН» и «СН». ЛД50 пропиленгли-коля для кроликов составляет 13,1 г/кг, для крыс — 6 г/кг. 1,2 ПД вызывает изменения на цитоплазматическом уровне [8]. Обладает протекторными свойствами в отношении различных клеток животных на более высоком уровне, чем глицерин и диметилсульфоксид [9].

Состав криоконсерванта « Пропандиоса-хароль»: Пропиленгликоль (1,2-ПД), 370 мл Сахароза, 32 г; Натрия хлорид, 6 г; Вода для инъекций — до 1000 мл; рН 5,5–7,5.

ЭМ смешивают с «Пропандиосахаролем» в соотношении 1:1, центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость, осадок — ЭМ помещают в криопакет, замораживают со скоростью 12–14оС/мин до температуры хранения –196оС. После размораживания гемолиз клеток не превышает 2–3 %. Пропиленгликоль от эритроцитов однократно отмывают 3 % раствором сахарозы.Его остаточное количество в среде составляет 0,3–0,5 %. Размороженные эритроциты хранят перед трансфузией в ресуспендирующем растворе ЦОЛИПК № 8-в не более 24 ч. Апробация клинического применения эритроцитов, криоконсерви-рованных с «Пропандиосахаролем», в Военно-медицинской академии им. С. М. Кирова ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России и Харьковской ОСПК выявила высокую физиологическую полноценность трансфузионной среды и эффективность избранной криотехнологии.

• 1.6.    Моноэндоцеллюлярный криоконсервант для замораживания тромбоцитов на основе диметилацетамида (ДМАЦ).

N, N-диметилацетамид (ДМАЦ). Химическая формула CH3C(O)N(CH3)2, м. м. — 73,10. Разрешен для клинического применения. ЛД50 для мышей составляет 4,2 г/кг (по другим данным 2,58–3,90 г/кг), для крыс — 3,56 г/кг [3]. Обладает высокой криозащитной активностью в отношении тромбоцитов,лей-коцитов и других клеток [3]. На основе ДМАЦ разработан гемоконсервант «Тромбокриод-мац» (ТКД) для замораживания тромбоцитов и метод длительного хранения тромбоцитных концентратов (КТ) при –196оС [4,10].

Состав «Тромбокриодмац»: N N-диметилацетамид, 50 мл; Глюкоза, 50 г Вода для инъекций — до 1000 мл; рН 4,0–5,5.

Приготовленный гемоконсервант стерилизуют при 1,2 атм 30 мин. Хранят при комнатной температуре в закрытом от света месте в течение 2 лет. Замораживание КТ по линейной программе проводят со скоростью 3оС/мин до –60оС, далее КТ переносят в жидкий азот (–196оС). После отогревания при + 38оС по тестам in vitro сохраняется более 80 % кровяных пластинок, из которых 50 % имеют биологическую полноценность.

В 2006 г. К. В. Кузнецовым и соавт. [11] в эксперименте разработан метод криоконсервирования КТ с раствором «Тромбокриод-мац» при низких (–80оС) температурах в пластикатных контейнерах «Гемакон 300» или «Компопласт 300» в режиме быстрого двухступенчатого замораживания с использованием электрических морозильников на –30оС и –80оС. Первоначально контейнеры с КТ помещают в морозильную камеру с этиловым спиртом, охлажденным до –30оС. На втором этапе, после достижения КТ температуры –29о÷30оС, биообъект переносят в хранилище на –80оС. Срок хранения КТ 12 мес.

• 1.7.    Моноэндоцеллюлярный криоконсервант на основе ДМАЦ для замораживания лейкоцитов при –196^оС

  В ГНЦ РАМН в 1985 году разработан криоконсервант на основе ДМАЦ для замораживания лейкоконцентратов — «Лейкокриод-мац » [5,12].

Состав гемоконсерванта «Лейкокриод-мац»: N, N-диметилацетамид (ДМАЦ), 200 мл; Глюкоза, 20 г; Динатриевая соль ЭДТА, 4 г Вода для инъекций — до 1000 мл; рН 4,5–5,5.

Стерилизуют автоклавированием при 1,2 атм 30 мин. Хранят в течение 2 лет. Смешивают с суспензией гранулоцитов 1:3, переводят в 100 мл пластикатные криоконтейнеры, замораживают со скоростью 3оС/мин до –196оС. Срок хранения в жидком азоте не более 2 лет. Размораживают в водяной ванне при + 39оС до температуры биопродукта 0о÷ + 2оС. В нем сохраняются жизнеспособными до78 % ядер-ных клеток.

• 1.8.    Моноэндоцеллюлярный криоконсервант на основе ДМАЦ для замораживания ГСК костного мозга при –196^оС.

В ВМА им. С. М. Кирова Р. В. Тюриным [13] на основе ДМАЦ разработан криоконсервант для замораживания ЯККМ (ГСК) при –196^оС следующего состава : N, N -диметилацетамид (ДМАЦ), 24 мл; Глюкоза, 40 г; Трилон Б, 0,4 г Вода для инъекций — до 1000 мл.

Перед началом криоконсервирования концентрат ЯККМ с ГСК разводят аутоплазмой 1:3.При использовании аллогенного костного мозга консервант разводят 1:3 сывороткой АВ(IV) группы.Затемегосмешивают 1:1 скон-центратом ЯККМ. Конечная концентрация ДМАЦ составляет 3 %. Время экспозиции — не более 15 мин. ГСК замораживают по программе: на первом этапе — 1оС/мин до начала кристаллизации, на втором — 5о-10оС/ мин до –150оС, затем переносят в хранилище с жидким азотом (–196оС) на срок до 1,5 мес. В размороженных ЯККМ сохраняется до 90 % колониеобразующих единиц грануломоно-цитопоэза (КОЕ-ГМ). ДМАЦ химически стоек малотоксичен и лишен свойственного ДМСО неприятного запаха.

• 1.9.    Моноэндоцеллюлярные криоконсерванты на основе диметилсульфоксида (ДМСО).

Диметилсульфоксид (ДМСО) — С2Н6SO является органическим веществом, относится кклассуоксидов,егом. м. —78,13.ДМСО хорошо проникает в клетки,реорганизует структуру образующегося льда — происходит его мелкоячеистая кристаллизация, близкая по своей природе к аморфной [3, 14]. Силы взаимодействия между молекулами ДМСО и воды в 1,5 раза больше, чем между молекулами воды [14]. Установлено [18], что в системах, содержащих ДМСО, в отличие от систем с криопротекторами из класса полиолов,про-исходит кристаллизация эвтектических составов. Это явление,наряду с девитрификацией, представляет собой дополнительный криоповреждающий фактор. Благодаря наличию кислорода, ДМСО обладает высокой способностью вступать в реакции с солями и оксидами фосфата, серы, формировать связи с глицерином, сахарозой, мочевиной, стеариновой кислотой и другими органическими соединениями. Известны противоишемиче-ское и антиоксидантное свойства ДМСО [15].

Впервые ДМСО в качестве протекторного средства предложили J. Lovelock и M. Bishop [19]. ДМСО был успешно испытан в клинике при криоконсервировании (–196оС) эритроцитов C. E. Huggins и лейкоцитов A. Rowe и E. Cohen [1].

ДМСОявляетсятоксичнымвеществомиоб-уславливает необходимость его отмывания после размораживания клеточной суспензии что существенно усложняет процедуру получения качественных деконсервированных клеток и приводит к потере части клеток в процессе отмывания [1, 2, 16]. По данным Е. Е. Rosenbaum [1], токсичность ДМСО на организменном уровне имеет видовую зависимость. ЛД50 при внутривенном введении для кроликов, обезьян, лабораторных мышей и собак составляет соответственно: 19,2 11,0; 3,8 и 2,5 г/кг веса. В последнее время для уменьшения токсичности ДМСО применяют более совершенные методы очистки вещества, а также используют в рецептах гемоконсервантов широкий спектр улучшающих «реставрирующих» добавок. Из последних методов стали использовать растворы декстрозы полиглюкина, гидроксиэтилкрахмала (ГЭК) или гексаметиленбистетрагидроксиэтилмо-чевина (ГМБТОЭМ).

• 1.10.    Моноэндоцеллюлярный криоконсервант на основе ДМСО для замораживания тромбоцитов при –80^оС и –196^оС и лейкоцитов при –196^оС.

Для консервирования КТ при –196 °C ДМСО применяют в концентрации 5–11 % [3 14, 15]. При этом сохранность клеток составляет 30÷80 %. Несмотря на то, что для снижения токсичности в раствор ДМСО вводилась гомологичная сыворотка, после замораживания-отогревания КТ находили снижение адгезивных свойств клеток, а у части кровяных пластинок — разрушения лизосом [1]. При переливании размороженных КТ, подвергнутых двукратному отмыванию, у 33 % реципиентов наблюдали озноб и лихорадку. Неприятным свойством ДМСО является нестойкость этого соединения при хранении. ДМСО достаточно быстро распадается при комнатной температуре с образованием токсического вещества с резким неприятным запахом диметилсульфида (СН2)2S [3].

Для консервирования лейкоконцентрата при –196°C ДМСО применяется в концентрации 6–15 %, при этом лимфоциты переносят замораживание вполне удовлетворительно а в ядрах и мембранах гранулоцитов обнаруживаются выраженные повреждения [1, 3]. Применяется ДМСО и для криоконсервирования ЯККМ,ГСК периферической и кордовой крови [1, 3]. В обзоре работ отмечено, что растворы ДМСО с применением разных составов гемоконсерванта в 5–20 % конечных концентрациях и разных программ замораживания-отогревания клеток обеспечивали сохранность до 80–90 % жизнеспособных миелока-риоцитов [1].

• 1.11.    Моноэндоцеллюлярный криоконсервант на основе ДМСО для замораживания ГСК костного мозга и периферической крови.

• 2.0. Биэндоцеллюлярный криоконсервант на основе пропиленгликоля и диметилацетамида для замораживания эритроцитов при –80^оС и –140^оС

  Авторами способа замораживания эритроцитов под защитой криоконсерванта на основе пропиленгликоля и диметилацетамида являются В. В. Вельяминов и Ш. М. Багаутдинов [1, 17]. Состав биокриоконсерванта включает: α-Пропиленгликоль (ВФС-42–1594–86) 370 г; ДМАЦ (N, N-диметиацетамид) х. ч. (ТУ 6–09–537–73, ГОСТ 3885–73, 100 г; Сахароза, чда, (ГОСТ 8833–75), 32 г; Натрия хлорид, чда, (ГФХ, с. 428,442), 6 г; Вода для инъекций (ГФХ, с. 74) до 1000 мл.

Конец ХХ и начало ХХI столетий ознаменовались активным совершенствованием методов получения и криоконсервирования выделенных ГСК. В 2003 г., согласно приказу Минздрава РФ № 325 «О развитии клеточных технологий», начали применять для клинических целей высокоочищенный ДМСО в криоконсерванте следующего состава : Высокоочищенный ДМСО 10 %, 30 мл; Поли-глюкин (м. м. —60 000), до 300 мл. рН 4,5–6,5.

Рабочий раствор ДМСО готовят непосредственно перед замораживанием ГСК. При соприкосновении с воздухом ДМСО окисляется и автоклавированию не подлежит: распадается на соединения, усиливающие токсичность химического вещества. Раствор ДМСО добавляют к полиглюкину (не наоборот!) доводя концентрацию ДМСО до 10 %, и ставят на хранение при + 4оС. Затем 10 % раствор ДМСО добавляют в клеточную взвесь 1:1 без образования пены,после чего переводят в криопакет, герметизируют и замораживают по двухэтапной программе: на первом этапе со скоростью 1оС/мин до –13оС, на втором — 10оС/мин до –80оС или –196оС. Продолжительность хранения ГСК при –80оС составляет 2 года, при –196оС — до 5 лет. Замороженные ГСК с ДМСО требуют быстрого отогревания в водяной ванне при + 39о÷41оС и последующего незамедлительного переливания паци- енту. Такая методика обеспечивает сохранение биологических свойств более, чем у 80 % миелокариоцитов.

Отмывание ДМСО от размороженных клеточных суспензий ведет к потере их части и снижает жизнеспособность последних на 30–40 %. Поэтому многие специалисты критически относятся к отмыванию размороженных ядерных клеток от ДМСО. Однако исследования показали, что на каждые 70 трансфузий неотмытых от ДМСО клеточных суспензий развивается одно посттрансфузионное осложнение,связанное с токсичностью известного криоконсерванта. В их числе: генерализованные судороги, энцефалопатия, спазмы сосудов, рвота, дыхательная недостаточность, неприятный запах выдыхаемого воздуха у реципиента и редко — коматозное состояние [16].

ЭМ из крови 1–2 суточного хранения при + 4оС смешивают 1:1 с криоконсервантом в полимерном пакете «Гемакон 500» при + 20оС÷ + 25оС. При этом конечная концентрация пропиленгликоля составляет 18,5 %, диметилацетамида — 5 %. Полученную ЭВ переводят в два контейнера «Компо-пласт 300», закладывают в металлические холдеры и помещают либо в электрический морозильник на –80оС, либо в пары жидкого азота на 35–40 мин, после чего замороженные клетки переносят в электроморозильник-хранилище на –80оС. Размораживание эритроцитов проводят в водяной ванне при + 42о÷45оС в течение 2–3 мин, отмывают общепринятым способом с использованием стандартных растворов с пониженной концентрацией солевых растворов до нормото- нии и ресуспендируют в растворе ЦНИИГПК № 8-в. После размораживания количество эритроцитов составляет (3,95±0,04)*1012/л уровень свободного гемоглобина — 0,69±0,05

г/л и соответствует (р>0,05) показателям эритроцитов, замороженных с глицерином до –196оС.