Чувствительность энтеробактерий, выделенных в кардиохирургическом стационаре, к антимикробным препаратам

Несмотря на возрастающую роль грампо-ложительных аэробных бактерий и грибов рода Candida в развитии тяжелых инфекций, одной из наиболее серьезных проблем в антимикробной химиотерапии остаются инфекции, вызванные энтеробактериями, продуцирующими β-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) [1, 2]. С одной стороны, сложность терапии «БЛРС-инфекции» связана с тем, что инфекции, обусловленные продуцентами БЛРС, чаще развиваются у пациентов в критическом состоянии, длительно находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии и имеющих тяжелую сопутствующую патологию. С другой стороны, тем, что БЛРС-проду-центы гидролизуют все β-лактамные антибиотики, за исключением цефамицинов и карбапенемов [2, 3]. В настоящее время карбапенемы рассматриваются как наиболее эффективные антимикробные препараты для лечения тяжелых внебольничных инфекций с полимикробной этиологией и для лечения тяжелых нозокомиальных инфекций, включая «БЛРС-инфекции» [3, 4]. В последнее время приобретенная устойчивость к препаратам этой группы встречается все чаще, особенно среди возбудителей нозокомиальных инфекций, что существенно затрудняет антимикробную терапию.

Материал и методы

Исследование проводилось в 2011– 2012 гг. В анализ включены все последовательно выделенные в клинике штаммы Enterobacteriaceae . Всего было изучено 124 штамма, выделенных от 123 пациентов. Посев первичного материала проводили общепринятыми методами. Для скрининга БЛРС-продуцентов в традиционный набор питательных сред для посева первичного материала включали хромогенные питательные агары BBL^TMCHROMagar^TMESBL и BBL^TMCHROMagar^TMCTX (CHROMagar, Франция). Бактерии семейства Enterobacteriaceae с одинаковой резистентностью (чувствительностью), повторно выделенные у одного пациента, из анализа исключались. Идентификацию проводили на автоматическом анализаторе Phoenix (Becton Dickenson, США).

Чувствительность штаммов энтеробактерий исследовали с помощью дисков, пропитанных антибиотиками (БиоРад, США) на агаре Мюллер-Хинтон (БиоМерье, Франция) диско-диффузионным методом (ДДМ) в соответствии с Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2 1890-04. 2004) [5]. На основании полученных значений зон подавления роста относили к категориям чувствительности – чувствительный (Ч), умереннорезистентный (УР), резистентный (Р), в соответствии с критериями CLSI М100-S22 (Clinical and Laboratory Standards Institute) [6].

Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) эрта-пенема, меропенема и имипенема определяли с использованием M.I.C. EvaluatorTMstrip (Oxoid, Великобритания). Интерпретацию полученных значений МПК проводили в соответствии с критериями EUCAST v3.0 (European Committee Antimicrobial Susceptibility Testing) [7].

Для фенотипического выявления продукции БЛРС использовали два метода. Первый заключался в выявлении синергизма между дисками цефотаксимом (30 мкг), цефтазидимом (30 мкг) и диском, содержащим комбинацию амоксициллина с клавулановой кислотой (20/10 мкг). Второй метод – в увеличении зоны задержки роста вокруг дисков, пропитанных цефотаксимом + клавуланат (30/10 мкг) и цефтазидимом + клавуланат (30/10 мкг), в сравнении с цефотаксимом (30 мкг) и цефтазидимом (30 мкг) на ≥5 мм [6].

Для обнаружения карбапенемаз класса А (КРС) использовали Modified Hodge Test (MHT) [6], для выявления продукции карбапенемаз класса В (MBL) – метод «двойных дисков» с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) [8].

Контроль определения чувствительности проводили в соответствии с рекомендациями CLSI М100-S22 с использованием референтных штаммов Американской коллекции типовых культур E. coli ATCC 25922 и K. pneumoniae АТСС 700603 и АТСС 35218.

У всех штаммов энтеробактерий методом ПЦР проводили определение гена CTX-M, выделение ДНК из первичного клинического материала проводили согласно инструкции производителя к набору реагентов «ДНК-Сорб-АМ» (ИнтерЛабСервис, Россия). Реакционная смесь для амплификации включала в себя смесь специфичных праймеров и набор реагентов «SsoFastEvaGreen» (Bio-Rad, США). Амплификацию проводили с использованием термоциклера CFX96 (Bio-Rad, США) по следующему протоколу: 1 цикл – 95,0 °С 3 мин; 40 циклов – 95,0 °С по 15 с, 58,0 °С по 20 с, 72,0 °С по 15 с; кривая плавления от 77,0 до 96,0 °С с инкрементом 0,5 °С. По образованию продукта амплификации делали заключение о наличии или отсутствии гена CTX-M. После этого проводили анализ кривых плавления положительных образцов. Заключение о типе гена CTX-M делали по температуре плавления продуктов амплификации: Тпл= 83,0 °С – CTX-M-1, Тпл= 84,5 °С – CTX-M-2, Тпл= 89,0 °С – CTX-M-8, Тпл= 90,5 °С – CTX-M-9.

Результаты

За период 2011–2012 гг. изучено 124 штамма энтеробактерий, из них 72 (58,1%) выделены из мочевыводящих путей, 45 (36,3%) – из респираторного тракта и 7 (5,6%) – из отделяемого в области операционной раны.

У 77 (62,1%) штаммов выявлена продукция БЛРС. Энтеробактерии, продуцирующие БЛРС, были представлены тремя видами: K. pneumoniae , E. coli и E. cloacae . Наибольшая доля продуцентов БЛРС зарегистрирована среди K. pneumoniae и составила 56 (45,2%), реже среди E. coli – 16 (12,9%) и 5 (4,0%) – среди E. cloacae (рис. 1).

Энтеробактерии, продуцирующие БЛРС, были изолированы в 6 отделениях клиники. Возраст пациентов, инфицированных БЛРС-штаммами, в пределах от 1 недели до 78 лет, средний – 52 года.

БЛРС-продуценты чаще были выделены из респираторного тракта – 37 (29,8%) штаммов, из мочевыводящих путей (МВП) – 35 (28,2%) штаммов и редко из отделяемого в области операционной раны – 5 (4,0%). Преобладающим возбудителем была K. Pneumoniae , доля которой при инфекции МВП составила 20,9% (26), при инфекции нижних дыхательных путей – 20,2% (25). Доля E. coli – 5,6% (7) среди изолятов из МВП и 7,2% (9) среди изолятов из респираторного тракта. E. cloacae – 1,6% (2) и 2,4% (3). При инфекции мягких тканей были выделены только K. pneumoniae , среди которых продуценты БЛРС составили 4,0% (5) (табл. 1).

У всех штаммов энтеробактерий, продуцирующих БЛРС, были выделены гены CTX-M-родственных ферментов. Идентифицированные CTX-M β-лактамазы относились к четырем генетически родственным группам: СТХ-М-1(СТХ-М-3), СТХ-М-2(СТХ-М-5), СТХ-М-8 (СТХ-М-8), СТХ-М-9 (СТХ-М-14) (рис. 2).

Наиболее часто были выделены гены СТХ-М-1(СТХ-М-3)-родственных ферментов, их доля составила 45,4% (35). БЛРС СТХ-М типа, относящиеся ко всем идентифицированным генетическим группам, изолированы в 72,7% (56 штаммов) у K. pneumoniae .

Результаты чувствительности энтеробактерий к антимикробным препаратам (АМП), полученные диско-диффузионным методом, показали широкое распространение нечувствительных штаммов к цефалоспоринам III–IV поколения (от 59 до 77 штаммов). Так, к цефотаксиму чувствительных энтеробактерий выявлено не было, только 3 (3,8%) изолята были умеренно резистентны и 74 (96,2%) резистентны. К цефтазидиму чувствительность сохраняли 14 (18,2%) штаммов, цефепиму – 18 (23,4%) (табл. 2).

Данные, представленные в табл. 2, также свидетельствуют о широком распространении нечувствительных штаммов к β-лактамным ингибиторзащищенным препаратам. Так, к амоксициллину/клавуланату были чувствительны только 23 (29,9%) штамма, 21 (27,3%) – к цефоперазону/сульбак-таму и 30 (38,9%) – к пиперациллину/тазобактаму. К аминогликозидам чувствительность энтеробактерий была выше в сравнении с β-лактамными препаратами. К амикацину были чувствительны 60 (77,9%) штаммов энтеробактерий, к нетилмицину – 56 (72,7%). Из группы фторхино-лонов нами тестировался ципрофлоксацин. К нему были чувствительны 23 (29,9%) изолята. К имипенему и меропе-

Инфекции

Таблица 1

Распределение энтеробактерий с БЛРС и без БЛРС в зависимости от локализации инфекций

Бактерии	мочевыводящих путей		респираторного тракта		области операционной раны
	БЛРС –	БЛРС +	БЛРС –	БЛРС +	БЛРС –	БЛРС +
K. pneumoniae	10 (8,1%)	26 (20,9%)	7 (5,6%)	25 (20,2%)	2 (1,6%)	5 (4,0%)
E. coli	7 (5,6%)	7 (5,6%)	–	9 (7,2%)	–	–
E. cloacae	20 (16,1)	2 (1,6%)	1 (0,8%)	3 (2,4%)		–
Итого	37 (29,8%)	35 (28,2%)	8 (6,4%)	37 (29,8%)	2 (1,6%)	5 (4,0%)

Таблица 2

Чувствительность энтеробактерий, продуцирующих БЛРС, к антимикробным препаратам, n = 77

Антибиотик Содержание антибиотика в диске, мкг/мл Критерии CLSI M100-S22 Категория чувствительности, абс. (%) Ч У/Р Р Ч У/Р Р Амоксициллин/клавуланат (АМС) 20/10 ≥18 14–17 ≤13 23 (29,9) 49 (63,6) 5 (6,%) Цефотаксим (СТХ) 30 ≥26 23–26 ≤22 – 3 (3,8) 74 (96,2) Цефтазидим (CAZ) 30 ≥21 18–20 ≤17 14 (18,2) 63 (81,8) Цефепим (FEP) 30 ≥18 15–17 ≤14 18 (23,4) 15 (19,5) 44 (57,1) Цефоперазон/сульбактам (CSF) 75 ≥21 16–20 ≤15 21 (27,3) 28 (36,4) 28 (36,4) Пиперациллин/тазобактам (TZP) 100/10 ≥21 18–20 ≤17 30 (38,9) 24 (31,1) 23 (29,9) Эртапенем (ETR) 10 ≥22 19–21 ≤18 70 (90,9) – 7 (9,0) Имипенем (IPM) 10 ≥23 20–22 ≤19 73 (94,8) 2 (2,6) 2 (2,6) Меропенем (MEM) 10 ≥23 20–22 ≤19 73 (94,8) – 4 (5,2) Амикацин (AN) 30 ≥17 15–16 ≤14 60 (77,9) 3 (3,9) 14 (18,2) Нетилмицин (NET) 10 ≥15 13–14 ≤12 56 (72,7) 2 (2,6) 19 (24,7) Ципрофлоксацин (CIP) 5 ≥31 21–30 ≤20 23 (29,9) 13 (16,9) 41 (53,2) нему были чувствительны 73 (94,8%) штамма. Несколько ниже чувствительность к эртапенему – 70 (90,9%) штаммов.

Результаты исследования МПК энтеробактерий к карба-пенемам выявили, что диапазон МПК эртапенема находился в пределах от 0,03 до 16,0 мкг/мл, меропенема – 0,12–8,0 мкг/мл и имипенема – 0,12–4,0 мкг/мл. МПК имипенема и меропенема для 50 и 90% штаммов была одинаковой и составила 0,25 и 1,0 мкг/мл, что соответствует категории «чувствительный». МПК эртапенема для 50% штаммов составила 0,12 мкг/мл (категория «чувствительный»), для 90% – 2 мкг/мл («устойчивый») (табл. 3). Диапазон МПК эртапенема, имипенема и меропенема у K. pneumoniae находился в пределах от 0,03 до 16,0, от 0,12

до 4,0 и от 0,12 до 8,0 мкг/мл, у E. coli – 0,06–0,5, 0,12–1,0 и 0,12–1,0 мкг/мл (табл. 4). МПК эртапенема у нечувствительных K. pneumoniae находилась в пределах от 2 до 16,0 мкг/ мл, меропенема – 4–8 мкг/мл и имипенема – 4 мкг/мл.

Из представленных в табл. 4 данных видно, что у 2 штаммов K. pneumoniae МПК имипенема и у 4 штаммов МПК меропенема была выше категории «чувствительный» (имипенема 4 мкг/мл и меропенема 4 и 8 мкг/мл). При этом МПК меропенема у одного штамма соответствовала пограничному значению (8 мкг/мл). К эртапенему у 7 K. pneumoniae МПК соответствовала категории «устойчивый». У всех штаммов K. pneumoniae, не чувствительных к имипенему и меропенему, и у 6, устойчивых к эрта-

Таблица 3

Результаты изучения у энтеробактерий МПК карбапенемов

Антибиотик	Диапазон МПК (мин.–макс.), мкг/мл	МПК50, мкг/мл	МПК90, мкг/мл
K. pneumoniae (n = 56)
Эртапенем	0,03–16,0	0,12	2,0
Имипенем	0,12–4,0	0,25	1,0
Меропенем	0,12–8,0	0,25	1,0
E. coli (n = 16)
Эртапенем	0,06–0,5	0,12	0,5
Имипенем	0,12–1,0	0,25	1,0
Меропенем	0,12–1,0	0,25	1,0
Все энтеробактерии (n = 77)
Эртапенем	0,03–16,0	0,12	2,0
Имипенем	0,12–4,0	0,25	1,0
Меропенем	0,12–8,0	0,25	1,0

Критерий

EUCAST Кол-во энтеробактерий, абс. (%) с различными значениями МПК карбапенемов, мкг/мл Антибиотик v3.0, мкг/мл

Ч ≤ Р > 0,03   0,06      0,12       0,25      0,5       1        2       4       8       16

K. pneumoniae (n = 56)

Эртапенем	0,5	1      5 (9,0)	7 (12,5)	17 (30,2)	14 (24,9)	5 (9,0)     –		3 (5,4)	1 (1,8)	2 (3,6)	2 (3,6)
Имипенем	2	8–	–	18 (32,1)	20 (35,7)	11 (19,6)	3 (5,3)	2 (3,6)	2 (3,6)
Меропенем	2	8–	–	23 (41,1)	18 (32,1)	9 (16,1)	2 (3,6)	–	3 (5,3)	1 (1,8)
E. coli (n = 16)
Эртапенем	0,5	1	5 (31,3)	6 (37,5)	4 (25,0)	1 (6,2)
Имипенем	2	8–	–	4 (25,0)	7 (43,7)	2 (12,5)	3 (18,8)	–	–	–
Меропенем	2	8–	–	7 (43,7)	5 (31,2)	2 (12,5)	2 (12,5)	–	–	–	–
Все энтеробактерии (n		= 77)
Эртапенем	0,5	1      5 (6,5)	11 (14,3)	27 (35,1)	19 (24,7)	7 (9,1)	3 (3,9)	–	1 (1,2)	2 (2,6)	2 (2,6)
Имипенем	2	8–	–	25 (32,4)	29 (37,9)	13 (16,8)	6 (7,8)	2 (2,6)	2 (2,6)
Меропенем	2	8–	–	33 (48,8)	24 (31,1)	12 (15,6)	4 (5,2)	3 (3,9)	–	1 (1,3)

Таблица 4

Частотная характеристика МПК карбапенемов у энтеробактерий

пенему, выделены гены СТХ-М-1(СТХ-М-3)-родственные ферменты и только у одного – устойчивого к эртапе-нему – идентифицирован ген СТХ-М-9 (СТХ-М-14) типа.

Обсуждение

Во всем мире основные проблемы терапии энтеробактерий связаны с продукцией БЛРС, при этом в России энтеробактерии, продуцирующие данные ферменты, имеют наиболее широкое распространение (средний показатель 81,4%) [1, 2]. В проведенных нами исследованиях (2008 г. и настоящее исследование) частота штаммов, продуцирующих БЛРС, не превышает 60% [9]. Большинство БЛРС, описанных до конца 1990-х годов, относилось к группам SHV и ТЕМ ферментам. В последние годы во многих странах мира и России отмечается стремительное распространение БЛРС СТХ-М-типа. Особенностью БЛРС CTX-M типа является более высокая способность гидролизовать цефе-пим (в сравнении с генами SHV и TEM) и in vitro сохранять чувствительность к цефтазидиму. Однако in vitro чувствительность к цефтазидиму у БЛРС-продуцентов не имеет клинического значения [1, 3, 10]. В настоящее время выявлены мутации у β-лактамаз CTX-M типа, в результате которых данные ферменты могут гидролизовать цефтазидим [10]. Данные нашего исследования также выявили широкое распространение нечувствительных штаммов к цефалоспоринам III–IV поколения (от 59 до 77 штаммов).

В исследованиях, проведенных в Испании, Израиле, Австрии, Канаде, Италии, Венгрии и России, было обнаружено, что продуценты CTX-M β-лактамаз часто бывают нечувствительны к не-β-лактамным препаратам [2, 8, 12]. По данным нашего исследования, только 23 (29,9%) штамма энтеробактерий сохраняли чувствительность к ципрофлоксацину. К аминогликозидам: амикацину и нетилми-цину – чувствительность была выше и соответствовала 77,9 и 72,7%. Наилучший клинический эффект при лечении инфекций, вызванных продуцентами БЛРС, достигается карбапенемными антибиотиками (прежде всего ими-пенемом и меропенемом) [3, 4]. Нами получены данные, свидетельствующие о сохранении чувствительности к препаратам этой группы большинства штаммов, выде- ленных в кардиохирургическом стационаре (к эртапе-нему – 70, к имипенему и меропенему – 75 и 73 штаммов). В рамках многоцентрового исследования, проведенного в России, получены данные, свидетельствующие о высокой активности цефоперазона/сульбактама в отношении энтеробактерий с БЛРС. По мнению авторов, цефопе-разон/сульбактам может быть использован для терапии инфекций, вызванных продуцентами БЛРС [1, 7]. В нашем исследовании чувствительность сохранял только 21 (27,3%) штамм, что позволяет использовать его для терапии «БЛРС-инфекции» лишь при подтвержденной чувствительности in vitro. Снижение активности цефоперазона/ сульбактама, вероятнее всего, обусловлено широким распространением энтеробактерий с БЛРС СТХ-М-типа [2].

В настоящее время у энтеробактерий выделены гены, ответственные за резистентность к карбапенемам, относящиеся к различным генетическим группам (KPC, NDM, IPM, VIM и OXA) [11, 12]. Нами фенотипически карбапенемазы выявлены не были. Все штаммы продуцировали БЛРС CTX-M типа. Различными авторами было установлено, что резистентность K. pneumoniae к карбапенемам может быть обусловлена и гиперпродукцией БЛРС в комбинации со сниженной проницаемостью наружной клеточной мембраны. Рядом исследователей получены данные об устойчивости K. pneumoniae к карбапенемам, продуцирующих БЛРС CTX-M-типа в сочетании с изменением проницаемости клеточной стенки из-за возникновения дефектов пориновых каналов или активным выведением антибиотика из микробной клетки (эффлюксом) [5, 11–14]. Вероятнее всего, штаммы K. pneumoniae , выделенные нами в кардиохирургическом стационаре обладают одним из указанных механизмов. Более высокая частота устойчивости энтеробактерий к эртапенему показана рядом авторов; эртапенем также может служить скринингом для изучения устойчивости к имипенему и меропенему [14].

Выводы

Проведенное исследование по изучению чувствительности энтеробактерий в кардиохирургическом стационаре выявило:

• 1.    Широкое распространение штаммов энтеробактерий, нечувствительных к цефалоспоринам III–IV поколения (от 76,6 до 100%), ингибиторзащищенным β-лактамным препаратам (от 62,0 до 72,7%) и фторхинолонам (70,1%).

• 2.    Высокую чувствительность энтеробактерий к карба-пенемам (к эртапенему 90,9%, имипенему и меропенему 94,8%), умеренную к аминогликозидам (амикацину – 77,9%, нетилмицину – 72,7%).

• 3.    Снижение чувствительности к карбапенемам обусловлено появлением штаммов K. pneumoniae с МПК эртапе-нема от 2 до 16 мкг/мл, меропенема 4–8 мкг/мл и с МПК имипенема 4 мкг/мл.

• 4.    Основным механизмом множественной устойчивости энтеробактерий к АМП является продукция БЛРС CTX-M типа.