Чужеродная генетическая информация как возможная причина эмбриональной смертности свиней

Среди факторов, обусловливающих темпы размножения животных, особое место занимают эмбриональные потери, которые могут достигать почти половины всех оплодотворенных овоцитов. Среди множества причин эмбриональной смертности важное место отводится генетическим и микробиологическим факторам (1). Однако, на наш взгляд, причины эмбриональной смертности этим не исчерпываются.

В процессе технологической обработки семени (разбавление, охлаждение, сохранение in vitro) целостность плазматических и других мембран сперматозоидов нарушается полностью или частично с последующим восстановлением. Вместе с тем в семя нередко вносится чужеродная генетическая информация из окружающей среды. Естественные и искусственно вносимые антимикробные вещества (антибиотики, сульфаниламидные и другие препараты), губительно действуя на микрофлору семени, освобождают большое количество нуклеиновых кислот из погибших клеток. В определенных условиях появляется возможность проникновения этой чужеродной информации в сперматозоиды, а затем в овоциты при оплодотворении. При этом экспрессия чужеродной ДНК в цитоплазме способна привести к синтезу белков, нарушающих эмбриональное развитие из-за расхода запаса аминокислот. Возможно, что высокая активность в семени животных нуклеаз, деполимеризующих нуклеиновые кислоты, является эволюционно выработанным средством устранения влияния этих факторов и соответственно причин эмбриональной смертности (2).

Однако разбавление семени уменьшает концентрацию нуклеаз пропорционально степени разбавления и снижает их активность в связи с ингибирующим действием компонентов сред, связывающих ионы Са++ и Mg++ — активные центры этих ферментов. На различных видах млекопитающих показано, что чужеродная генетическая информация в виде генных конструкций может переноситься сперматозоидами в процессе оплодотворения в овоциты и даже включаться в пронуклеусы (3-7). В опытах на кроликах установлена экспрессия чужеродной ДНК и выявлены нарушения в развитии эмбрионов вплоть до их полной гибели (8).

Возникает вопрос, ответ на который имеет как теоретическое, так и практическое значение: в какой мере это явление присуще другим видам животных, в частности свиньям? В связи с этим целью наших исследований было выяснение возможности переноса чужеродной генетической информации сперматозоидами, находящимися в искусственных средах, нуклеазная активность в которых снижена или подавлена, и последующего влияния этих условий на эмбриональную выживаемость и качество потомства свиней.

Методика. При определении ДНК-азной активности плазмы семени хряков сперматозоиды отделяли от плазмы центрифугированием, убивали их обработкой 96 ^о этанолом, трижды отмывали 1 % раствором NaCl, затем инкубировали при 37 ^оС в течение 4 ч как в присутствии плазмы, так и без нее альтернативно в двух буферах — трис-хлоридном (рН 7) и ацетатном (рН 5,6). Концентрацию ДНК определяли во всех образцах до и после инкубации по методике Шмидта-Тангаузера в модификации Ца-нева с соавт., которая позволяет выявлять ДНК сколь угодно малой полимерности, исключая лишь отдельные нуклеотиды (9).

Концентрацию ДНК в нативных сперматозоидах определяли до и после инкубации разбавленного семени. При этом использовали разные разбавители семени (рН 7): среда, включающая анионы этилендиаминтетраацетат динатриевой соли (ЭД-ТА) и цитрат, которые, связывая ионы Са++ и Mg++, ингибировали нуклеазы; изотонический раствор гликокола, сохраняющий нуклеазы активными.

Осеменение свиноматок проводили в ЗАО «Кузнецовский комбинат» в условиях промышленного производства свинины с января по август 2000 года. При этом эякуляты одного или нескольких хряков разделяли на три равные части, каждую из которых разбавляли в соотношении 1:2 следующими растворами: глюкозо-хелато-цитратно-сульфатная среда (ГХЦС), где нуклеазная активность была ингибирована; изотонический раствор хлористого натрия, где концентрация нуклеаз была понижена в 3 раза; естественная плазма семени, имеющая нормальную нуклеазную активность. В соответствии с принятой технологией проводили искусственное осеменение основных свиноматок — аналогов по происхождению и возрасту.

Результаты . Инкубация мертвых сперматозоидов в плазме семени вызывала существенное снижение содержания ДНК в клетках при нейтральной реакции среды (табл. 1). Это означает, что в плазме семени возможна деполимеризация ДНК до отдельных нуклеотидов.

1. Содержание ДНК в убитых сперматозоидах при разных условиях инкубации
Исследуемый фермент	рН инкубационной среды	Содержание ДНК в навеске до инкубации, мг	Содержание ДНК в навеске после инкубации, мг
			с плазмой семени		без плазмы
			мг/млрд сперматозоидов	% к исходному	мг/млрд сперматозоидов	% к исходному
ДНК-аза 1	7,0	3,4	2,5	74	3,4	100
ДНК-аза 2	5,6	3,2	3,1	97	3,3	103

При инкубации живых сперматозоидов в среде, содержащей компоненты, деионизирующие ионы Са++ и Mg++, ДНК сохранилась (табл. 2). Вместе с тем, если сперматозоиды инкубировали в среде, где ионы Са++ и Mg++ не были связаны, наблюдалось заметное снижение содержания ДНК уже через 3 ч, очевидно, вследствие деполимеризующего действия нуклеаз плазмы семени. Следовательно, среды, содержащие компоненты, связы- вающие активные центры нуклеаз (Са++ и Mg++), предотвращают деполимеризацию ДНК.

2. Содержание ДНК в нативных сперматозоидах при различных условиях инкубации в естественной плазме семени (мг/10⁹ клеток)

Среда инкубации	Содержание ДНК в сперматозоидах после инкубации при 37 оС в течение:
	0 ч	]          3 ч          1	6 ч
ЭДТА + цитрат	3,04 ± 0,03	3,06±0,04	3,00 ± 0,12
2,5 % раствор гликокола	3,07 ± 0,05	2,85±0,06	2,85 ± 0,08

П р и м е ч а н и е. ЭДТА — этилендиаминтетраацетат динатриевой соли.

Доля опоросов от числа осемененных самок была практически одинаковой при использовании в качестве разбавителя семени как ГХЦС, так и NaCl (табл. 3). Однако применение семени, разбавленного нативной плазмой, способствовало повышению результативности осеменения: доля опоросов от числа осемененных маток была на 9 и 11 % выше, чем в группах, где в качестве разбавителя использовали соответственно ГХЦС и NaCl.

3. Результативность осеменения свиноматок свежевзятым семенем под влиянием различных разбавителей

Разбавитель	Число осемененных маток	Количество перегулов позднее чем через 21 сут после осеменения		Количество опоросившихся маток		Получено живых поросят
		n 1	%	гол. 1	%	всего 1	на один опорос
ГХЦС	40	7	18 ± 6	32	80 ± 6	343	10,7 ± 0,4
1 % NaCl	36	2	6 ± 4	28	78 ± 6	287	10,3 ± 0,5
Плазма семени	36	1	3 ± 3	32	89 ± 5	319	10,0 ± 0,5

Разбавитель

Число осеменен-

Количество перегулов позднее чем через 21 сут

Количество опоросившихся маток

Получено живых поросят

ных маток

после осеменения

П р и м е ч а н и е. ГХЦС — глюкозо-хелато-цитратно-сульфатная среда.

Известно, что межтечковый период у свиней составляет 18-21 сут. Большая продолжительность этого периода свидетельствует об оплодотворении, закончившемся ранней эмбриональной смертностью. Нами выявлено большое количество удлиненных межтечковых интервалов в тех вариантах опыта, в которых для разбавления семени использовали среду ГХЦС, связывающую ионы Са++ и Mg++ и соответственно ингибирующую нуклеазы. Это подтверждает нашу точку зрения о возможной причине эмбриональной смертности у млекопитающих — переносе чужеродной генетической информации сперматозоидами в овоцит в процессе оплодотворения. Присутствие нуклеаз в семени — вероятно, эволюционно выработанное средство защиты от чужеродной генетической информации.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    С о к о л о в с к а я И.И., Р ы м а р ь М.А., Б о н д а р е в с к а я Л.Ф. и др. Метод снижения эмбриональной смертности у свиней. В сб.: Разведение и биология размножения животных. М., 1968: 304307.

• 2.    P o l a k o v s k i K.L., K o p t a M. Seminal plasma. Biochemistry of Mammalian Reproduction /Egs L.J.D. Zanefeld, R.T. Chatterton, N.-Y., 1982: 89-117.

• 3.    L a v i t r a n o M., C a m a i o n i A., F a z i o V.M. e.a. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell, 1989, 57: 717-723.

• 4.    G a n d o l f i F., L a v i t r a n o M., C a m a i o n i A. e.a. The use of sperm-mediated gene transfer for the generation of transgenic pigs. J. Reprod. Fert. Abstr., 1989, 4: 21.

• 5.    H o c h i S.-I., N i n o m i y a T., M i z u n o A. e.a. Fate of exogenous DNA carried into mouse eggs by spermatozoa. Animal Biotech., 1990, 1(1): 21-31.

• 6.    К у з н е ц о в а И.В., К у з н е ц о в А.В., С и г а е в а В.А. и др. Использование сперматозоидов кролика в качестве вектора для чужеродной ДНК. Биотехнология, 1993, 11-12: 2-5.

• 7.    P e r e z A., S o l a n o R., C a s t r o F.O. e.a. Sperm cells mediated gene transfer in cattle. Biotecnologia Aplicada, 1991, 8(1): 90-94.

• 8.    К о н о н о в В.П., Б а г и р о в В.А. О некоторых причинах эмбриональной смертности у животных. Докл. РАСХН, 1996, 6: 37-38.

• 9.    Ц а н е в Р.Г., М а р к о в Г.Г. К вопросу о количественном спектрофотометрическом определении нуклеиновой кислоты. Биохимия, 1960, 25, I: 151-159.

Всероссийский НИИ свиноводства , 142023, Московская обл., Подольский р-н, пос. Быково