Цирковирус-микоплазменная инфекция поросят в эксперименте

Введение. Цирковирусная инфекция свиней, или ЦВИС (англ. PCVAD), клинически проявляется как синдром постеотъемного мультиси-стемного истощения поросят (сокр. СПМИ, англ. PMWS), синдром дерматита и нефропатии свиней (англ. PDNS), комплекс респираторных заболеваний свиней (сокр. КРЗС, англ. PRDC – Porcine Respiratory Disease Complex), врожденный тремор поросят типа А2 (Congenital tremor, CT), а также нарушение репродуктивной функции у беременных свиноматок – все эти патологии в совокупности связаны с цирковирозом свиней [1–3]. Считается, что PCV2 играет важную роль в некоторых случаях комплекса респираторных заболеваний свиней (PRDC), вызванных патогенами вирусного (РРСС, КЧС, эн-тертеровирусы и др.) или бактериального происхождения ( Mycoplasma hyopneumoniae , Actinobacillus pleuropneumoniae , Pasteurella multocida , Bordetella bronchiseptica ). Миксинфек-ции приводят к обострению симптомов поражения дыхательной системы, развитию пневмонии и других патологий, быстрому летальному исходу [4–8].

Микоплазменная пневмония свиней – хроническое респираторное заболевание, вызываемое в условиях китайского свиноводства чаще всего возбудителем Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo), больше известна как астма свиней. Пневмония, вызванная M. hyo, характеризуется высокой заболеваемостью и низкой смертностью, часто коинфицируется другими патогенами, в т. ч. цирковирусом, наносит значительный экономический ущерб свиноводству [9, 10].

Цель исследований – изучить проявление цирковирус-микоплазменной инфекции у поросят как в виде смешанной инфекции, так и моноинфекции в эксперименте.

Задачи: изучить взаимодействие цирковиру-са 2-го типа с Mycoplasma hyopneumoniae в организме поросят отъемного возраста, а также проявление моноинфекции у поросят при экспериментальном заражении; дать оценку патогенности миксинфекции PCV2d/M. hyo, моноинфекции PCV2d и моноинфекции M. hyo; выявить клиническое и патоморфологическое проявление смешанной и одиночной инфекции циркови-руса и микоплазмы в эксперименте.

Материалы и методы. Исследования проводили в лабораториях College of Life Engineering, Shenyang Institute of Technology. Были сформированы 4 группы 23-дневных поросят (по 5 голов), которых проверили на отсутствие патогенов. При подготовке эксперимента мы выделили цирковирус 2-го типа из ряда предполагаемых случаев PCV2-инфекции свиней на фермах северо-восточных провинций Китая за последние годы в соответствии с документированными методами. Изоляты PCV2/LG были стандартизированы, идентифицированы и сохранены в нашей лаборатории. Штамм М. hyo-BXX был выделен из образца ткани легкого на свиноферме в округе Бэньси, Ляонин, Китай. Клетки M. hyo пятого поколения, культивированные в микоплазменной питательной среде, использовали в качестве инокулята для экспериментального заражения [11].

Поросят опытной группы I последовательно заражали M. hyo в 1-й день и PCV2d в 7-й день (группа миксинфекции). Опытной группе II инокулировали PBS (физиологический раствор) в 1-й день, а PCV2d (цирковирус 2-го типа) на 7-й день. Путь заражения PCV2d – трахея, брюшная полость и внутримышечная инъекция, по 1 мл на каждый путь заражения, общая доза составляла 3 мл на голову. Опытной группе III инокулировали M. hyo в 1-й день эксперимента; путь заражения M. hyo – трахея и внутрибрюшинная инъекция, по 1 мл на каждый путь заражения, общая доза 2 мл на голову. Контрольной группе вводили по 1 мл PBS тем же путем (рис. 1). После заражения поросят каждой опытной группы и контрольной группы содержали изолированно.

После экспериментального заражения поросят наблюдали и записывали клинические проявления, температуру тела, взвешивали; брали кровь и мазки из носа у каждого животного на 3-, 5-, 7-, 10-, 14-, 21-, 28- и 35-й день после заражения.

Метод ПЦР использовали для выявления сывороточной виремии и нуклеиновой кислоты PCV2d в различных тканях на 0-, 7-, 14-, 21-и 28-й день после инфицирования PCV2d. Уровни антител к PCV2 в сыворотке определяли по методу ELISA и методу анализа монослоя иммунопероксидазы (IPMA) [12]. Определяли количество копий нуклеиновой кислоты M. hyo в мазке из носа и в легочной ткани методом количественной ПЦР.

Схема исследования

Рис. 1. Схема экспериментального исследования

В конце эксперимента провели эвтаназию поросят, патолого-анатомическое вскрытие; в соответствии с системой оценки поражений легких, установленной Гудвином (1969); была проведена макроскопическая патологическая оценка легких подопытных животных [13]. Кусочки ткани легких и паховых лимфатических узлов поместили в 10 %-й раствор формалина и отправили в Shenyang Sail Biological Reagent Company для изготовления парафиновых сре-

Таблица 1

Клиническое проявление инфекции в группах поросят при проведении эксперимента

Показатель	Опытная группа I (М.hyo/PCV2d )	Опытная группа II (PCV2d )	Опытная группа III (М.hyo )	Контрольная группа IV
Взъерошенная «грубая щетина»	4/5	2/5	0/5	0/5
Кашель	5/5	2/5	3/5	0/5
Одышка	4/5	1/5	3/5	0/5
Истощение	5/5	2/5	1/5	0/5
Диарея	1/5	0/5	0/5	0/5
Угнетение	2/5	1/5	0/5	0/5

Примечание : 2/5 – проявление симптома у двух поросят из пяти в группе; 0/5 – ни у одного животного из пяти симптом не проявился.

При введении инокулята M. hyo как в группе с миксинфекцией M. hyo/PCV2d, так и в группе с моноинфекцией M. hyo наблюдалась преходящая потеря аппетита и повышение температуры тела, достигавшей 41,2 °C на четвертый день и зов, приготовили гистопрепараты для гистопатологического исследования.

Результаты и их обсуждение. Клиническое проявление развития инфекционного процесса в ходе эксперимента наиболее выраженным было в опытных группах I и III, в то время как клиническое проявление цирковирусной моноинфекции у зараженных поросят опытной группы II не выражено (табл. 1).

продолжавшейся в течение 3–4 дней. Спад температуры до нормы отмечен на 7-й день. Не отмечено повышения температуры тела в группе с моноинфекцией PCV2d и в контрольной группе (рис. 2).

Рис. 2. Изменение температуры тела поросят в каждой группе при проведении эксперимента

После инфицирования на 21-й день среднесуточный прирост в группе с миксинфекцией M. hyo/PCV2d составил (305,4 ± 11,1) г/сут, что на 22,85 % ниже, чем в контрольной группе.

В группе моноинфекции M.hyo среднесуточный прирост составил (320,6 ± 1) г/сут, что на 19,17 % ниже, чем в контрольной группе. Среднесуточный прирост в группе моноинфекции

ЦВС2d составил (376,7 ± 11,1) г/сут, что на 4,85 % ниже, чем в контрольной группе. Таким образом, ежедневный прирост подопытных поросят в группе со смешанным инфицированием M. hyo/PCV2d и в группе с моноинфекцией M. hyo был значительно ниже, чем в группе с однократным инфицированием PCV2d и кон- трольной группе (табл. 2). Не было существенной разницы между группой с моноинфекцией PCV2d и неинфицированными поросятами (P > 0,05), а также не было значимой разницы между группой с моноинфекцией M.hyo и группой с миксинфекцией M. hyo/PCV2d (P > 0,05).

Таблица 2

Дни наблюдений	Группа I (М. hyo / PCV2d )	Группа II (ЦВС-2d)	Группа III (М. hyo )	Группа IV (контроль)
29–35 дней (1–7 DPC)	294,4 ± 6,7	300,0 ± 11,7	276,9 ± 2,7	297,1 ± 20,2
35–49 дней (7–21 DPC)	305,4 ± 11,1	376,7 ± 11,1	320,6 ± 14,2	395,9 ± 24,5
49–63 дня (21–35 DPC)	401,6 ± 11,6	490,2±10,3	421,6 ± 20,4	511,2 ± 32,4

Примечание : DPC – дни после заражения.

Изменение среднесуточного прироста поросят в каждой опытной группе и контрольных поросят (X ± SE г/сут)

Самая ранняя виремия в группе миксинфек-ции M. hyo/PCV2d была положительной на 14-й день после инфицирования PCV2d, в то время как в группе моноинфекции PCV2d положительная реакция наблюдалась на 21-й день после инфицирования. Результаты выявления антител к M. hyo показали, что средний титр антител в сыворотке в группе с моноинфекцией M. hyo был выше, чем в группе миксинфекции, причем титр в сыворотке достиг пика на 10-й день после инокуляции M. hyo, а затем начал снижаться. Как в группе с миксинфекцией M. hyo/PCV2d, так и в группе с моноинфекцией PCV2d антитела к PCV2d начали появляться через 7 дней после инфицирования цирковирусом.

Обнаружение числа копий нуклеиновой кислоты в ходе эксперимента в мазках из носа опытных поросят выявило, что как в группе мик-синфекции M. hyo/PCV-2d, так и в группе моноинфекции M. hyo самое высокое их число отмечено на 14-й DPC (дней после заражения), разница незначительна (P > 0,05). Посмертное определение содержания нуклеиновой кислоты PCV2d в ткани пахового лимфатического узла показало, что по сравнению с поросятами, инфицированными только PCV2d, число копий генома цирковируса в группе миксинфекции M. hyo/PCV2d было выше (P < 0,05). Количество копий нуклеиновой кислоты M. hyo в легких было значительно выше в группе миксинфекции M. hyo/PCV2d, чем в группе моноинфекции M. hyo (P < 0,05).

Морфологические изменения в легких у поросят опытных групп, а также их патоморфоло-гическая оценка показали, что как в группе моноинфекции M. hyo, так и в группе миксинфек-ции M. hyo/PCV2d наблюдались различные степени креветкоподобных изменений в легких (уплотнения и ателектатические темно-красные участки), с наиболее выраженными поражениями в сердечной доле и верхушечной доле (рис. 3). Патологические изменения с обеих сторон примерно симметричны, цвет очага серокрасный, границы четкие, форма мышечная, «мясистая». Прикорневые и диафрагмальные лимфатические узлы увеличены, окаймлены гиперемией. Согласно шкале консолидации легких, тяжесть поражений легких в группе мик-синфекции M. hyo/PCV2d была выше, чем в группе моноинфекции M. hyo.

Патогистологическими исследованиями выявлено, что в группе с моноинфекцией M. hyo альвеолярная перегородка была значительно расширена, альвеолярный экссудат и эозинофильная жидкость увеличились от умеренной до сильной степени, а оставшиеся альвеолы были явно отечными (рис. 4). Однако в группе моноинфекции PCV2d микроскопические поражения в легочной ткани были значительно уменьшены, и произошло лишь небольшое расширение альвеолярных перегородок. В контрольной группе не было явных поражений легочной ткани.

Рис. 3. Морфологические изменения в легких в разных экспериментальных группах:

A – опытная группа I, миксинфекция M. hyo/PCV2d; B – опытная группа III с моноинфекцией M. hyo; C – опытная группа II с моноинфекцией PCV2d; D – контрольная группа (норма)

Рис. 4. Результаты гистологических исследований легких у животных различных опытных групп: А – опытная группа I, наблюдается умеренное расширение альвеолярных перегородок; В – поражение легких связано с интерстициальной пневмонией (опытная группа III);

С – пневмония в группе моноинфекции PCV2d (опытная группа II), альвеолярные перегородки слегка расширены; D – контрольная группа (IV) представляет собой нормальную здоровую легочную ткань

При гистологическом исследовании паховых лимфатических узлов патология проявляется в виде слабой или тяжелой лимфоидной недостаточности и гранулематозного воспаления лимфоидных органов от легкой до тяжелой степени. В группе миксинфекции M. hyo/PCV2d количество локальных лимфоцитов уменьшилось, а эозинофилов было рассеяно много; в группе моноинфекции M. hyo не наблюдалось выраженной лимфопении; в группе моноинфекции PCV2d наблюдался некроз лимфоцитов в локальных участках, а их количество уменьшилось, отмечена эозинофильная инфильтрация; в контрольной группе выраженной лимфопении не обнаружено. Порядок тяжести был следующим: группа миксинфекции M. hyo/PCV-2d, группа моноинфекции PCV-2d, группа моноинфекции M. hyo. Паховые лимфоидные ткани поросят контрольной группы соответствовали показателям нормы.

Заключение. Проведенное экспериментальное исследование раскрывает синергетическую патогенность PCV2d и M. hyo при миксинфек-ции. Все показатели мониторинга показывают, что PCV2d и М. hyo обладают синергетической патогенностью, которая может вызывать сильную воспалительную реакцию в организме и способствовать репликации цирковируса второго типа в различных органах, вызывая клинические симптомы и патологические изменения, связанные с PRDC. В то же время инфекция M. hyo увеличивала частоту заболеваний, связанных с PCV2d, а также в определенной степени усугубляла клиническую симптоматику и патологические изменения, вызванные M. hyo.

При экспериментальном заражении поросят отъемного периода как моноинфекцией M. hyo, так и миксинфекцией M. hyo/PCV2d выявлено, что нуклеиновая кислота M. hyo в мазке из носа обнаружена у 80 % животных, а в легочной ткани – у 100 %. При этом количество копий нуклеиновой кислоты микоплазмы в легочной ткани в группе миксинфекции M. hyo/PCV2d было значительно выше, чем в группе с моноинфекцией M. hyo (P < 0,05). Это свидетельствует, что вирулентность микоплазмы и восприимчивость свиней вызывают пневмонию, которая может проявляться как комплексное респираторное заболевание у свиней, обусловленное несколькими патогенами. Кроме того, число копий генома цирко- вируса PCV2d в ткани пахового лимфатического узла у поросят в группе с миксинфекцией было выше по сравнению с поросятами, инфицированными только PCV2d. Однако патогенный механизм смешанной цирковирус-микоплазменной инфекции все еще мало изучен.

В результате проведенных нами исследований выявлено, что клиническое проявление цирковирусной инфекции у зараженных PCV2d поросят отъемного возраста не выражено. Только у одного животного из 5 (20 %) появились признаки респираторной инфекции. Таким образом, цирковироз второго типа у поросят может протекать латентно, а цирковирус-микоплазменная инфекция – как комплексное респираторное заболевание, что необходимо учитывать в производственных циклах ведения свиноводства.