Циркулирующие в крови стволовые клетки: динамика и значение при остром инфаркте миокарда

Острый инфаркт миокарда (ИМ) остается основной причиной развития хронической сердечной недостаточности (ХСН), которая приводит к инвалидизации и смертности больных во всем мире. Несмотря на успехи современных консервативных и оперативных методов лечения, проблема прогрессирования данных патологий со- храняется. Относительно новым направлением в лечении ишемической болезни сердца являются клеточные технологии. Несколько лет назад в кардиологической практике начался бум по изучению и применению стволовых клеток (СК). При этом в экспериментальных [1, 2, 11, 14] и клинических [5, 6, 8–10, 16] работах изучались различные типы СК: эмбриональные, фетальные и СК взросло- го организма. Основным или наиболее изученным источником СК является костный мозг (КМ). Фетальный и взрослый КМ содержит три особенно многочисленные популяции СК – гематопоэтические СК (ГСК), мезенхимальные СК (МСК) и предшественники эндотелиоцитов (ПЭ), различающихся по фенотипу [4]. Каково же участие КМ при развитии ишемии органа?

Ишемическое повреждение приводит к выбросу из очага повреждения таких цитокинов, как сосудистый эндотелиальный фактор роста-2 (VEGF-2), фактор стромальных клеток-1 (SDF-1), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), фактор стволовых клеток (SCF) и другие. Эти цитокины, воздействуя на свои рецепторы, обеспечивают выброс СК из КМ и их привлечение в очаг повреждения [3].

Количество СК в крови при остром ИМ возрастает в течение 12 часов после возникновения симптомов и остается значительно более высоким по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией и здоровыми лицами [15]. Сходная картина описана и Shintani [12]. Кроме того, в условиях эксперимента показано, что циркулирующие СК КМ принимают участие в процессах восстановительной регенерации миокарда. Это происходит за счет паракринных эффектов данных СК, стимуляции неоангиогенеза, что в конечном итоге приводит к предупреждению дезадаптивного постинфарктного ремоделирования сердца [3]. Имеющаяся небольшая информация по циркулирующим СК при остром ИМ обусловила выбранное нами направление поиска. Цель исследования: определить динамику и значение циркулирующих в крови CD34+38-, CD133+, СD117+, CD90+34- клеток у больных острым первичным крупноочаговым ИМ. CD34+38-клет-ки являются фенотипически чистой популяцией ГСК. По характеристикам светорассеяния данный фенотип СК соответствует малому, среднему или крупному лимфоциту. Данная популяция клеток обладает способностью дифференцироваться в различные типы клеток (клеток крови, кардиомиоциты, гепатоциты) в зависимости от микроокружения [13]. CD133+, СD117+ клетки относятся к незрелым ГСК и являются эндотелиальными клетками-предшественниками костномозгового происхождения. Таким образом, они могут улучшать сердечную функцию после ИМ путем неоваскуляризации. CD90+34-клетки относятся к МСК и клеткам – предшественникам лимфоцитов.

Материал и методы

В исследование включены 19 пациентов, из которых 14 (74%) мужчин и 5 (26%) женщин в возрасте 58±20 лет. У всех пациентов (100%) диагностирован острый первичный передний крупноочаговый ИМ. При поступлении в стационар 4 (47%) больным выполнена первичная ангиопластика. У 2 (11%) больных наступила спонтанная реперфузия инфарктсвязанной коронарной артерии (ИСКА). Остальным 13 (68%) больным проводилась ТЛТ стрептокиназой 1,5 млн ЕД, из которых 2 (15%) больным в последующем выполнена спасительная ангиопластика, а 11 (85%) – отсроченная ангиопластика. Среднее время реканализации ИСКА от начала ИМ составило 5,0 (4,4; 6,0) часов. Клиническое течение ИМ оценивали по данным общепринятых физикального, рентгенологического, электро-, эхокардиографического и лабораторных методов исследования. Все пациенты подписали информированное согласие на проведение клинического исследования.

Всем больным проведен забор цельной крови в количестве 2 мл, взятой с ЭДТА из локтевой вены на 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки ИМ с целью определения CD34+38-, CD133+, CD117+, CD90+34-клеток методом проточной ци-тофлуориметрии на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). Подсчитывали абсолютное и относительное содержание клеток. Для сравнения проводился однократный забор крови у группы здоровых добровольцев в количестве 6 мужчин, средний возраст – 41±9 лет. На момент включения и обследования добровольцы были абсолютно здоровы. Острых воспалительных заболеваний либо обострений хронических заболеваний не отмечено. Кроме того, обязательным условием включения было отсутствие анамнеза сердечно-сосудистых заболеваний.

Выполняли эхокардиографическое исследование (ультразвуковая система VIVID 7, GE Vingmed Ultrasound, Norway) в день поступления, на 3-и, 7-е и 21-е сутки ИМ. Оценивали показатели глобальной систолической функции левого желудочка (ЛЖ): конечный диастолический объем (КДО), конечный систолический объем (КСО) и фракцию выброса (ФВ) ЛЖ.

Статистический анализ данных выполнен с использованием программы Statistica v6.0. Проверка нормальности распределения производилась методом Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллиефорса. В связи с ненормальным распределением при анализе количественных и качественных признаков применялись непараметрические методы – тест Манна–Уитни и корреляционный анализ с помощью коэффициента Спирмена (R). Средние выборочные значения количественных признаков приведены в тексте в виде Ме (25;75), где Ме – медиана, 25 – нижний квартиль, 75 – верхний квартиль. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости р принимался равным 0,05. В случае р более 0,05, но менее 0,1 говорили о тенденции к достоверности различий.

Результаты и обсуждение

Нами впервые продемонстрирована динамика содержания циркулирующих в крови CD34+38-, CD133+, CD117+, CD90+34- клеток у больных острым первичным крупноочаговым ИМ (рис. 1–4). Абсолютное и относительное количество исследованных СК было значительно выше у пациентов с острым ИМ на протяжении всего периода наблюдения в сравнении со здоровыми добровольцами. В большинстве случаев максимальный выброс СК в кровь наблюдается в ранние сроки острой миокардиальной ишемии.

Изучение взаимосвязей между содержанием исследованных СК, циркулирующих в периферическом русле, в 1-е сутки ОИМ и основными клинико-анамнестическими параметрами показало, что такой фактор риска ИБС, как курение влияет на содержание абсолютного и относительного количества CD90+34-клеток; что половой при- знак и наличие отягощенной наследственности в анамнезе взаимосвязаны с исходным уровнем относительного количества CD133+ клеток. А именно: у курильщиков исходный уровень CD90+34-клеток в крови был ниже, чем у больных без данной вредной привычки. У пациентов женского пола и пациентов с отягощенной наследственностью по ССЗ в анамнезе относительное количество CD133+ клеток в крови в 1-е сутки острого ИМ было высоким в отличие от пациентов, не имеющих в анамнезе сердечно-сосудистой патологии.

Проводя индивидуальный анализ изменения количества CD34+38-, CD133+, CD117+, CD90+34- клеток у больных острым ИМ, мы обнаружили нелинейную, разнонаправленную динамику их содержания к 3-м суткам заболевания. В зависимости от этой динамики всех больных разделили на 2 подгруппы: 1-ю подгруппу составили пациенты с исходно низким

CD 117+ клетки, абсолютное кол-во                        CD 117+ клетки, относительное кол-во

Рис. 1. Динамика абсолютного и относительного количества CD117+ клеток в крови в 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки острого инфаркта миокарда: * – различия между больными и добровольцами, p<0,05; ** – различия относительно исходных значений внутри группы, p<0,05

Рис. 2. Динамика абсолютного и относительного количества CD133+ клеток в крови в 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки острого инфаркта миокарда: * – достоверность различий показателя между больными и добровольцами, p<0,05

содержанием клеток и их повышением на 3-и сутки заболевания, 2-ю подгруппы – пациенты с высоким содержанием клеток в начале ИМ и динамикой их уменьшения на 3-и сутки. Исследуемые подгруппы по основным клинико-анамнестическим, эхокардиографическим показателям были сопоставимы.

Изучались взаимосвязи между содержанием количества CD34+38-, CD133+, CD117+, CD90+34- клеток и основными функциональными параметрами сердца, такими, как КДО, КСО и ФВ ЛЖ. Выявлено, что максимальный выброс CD117+кле-ток в кровь в 1-е сутки ИМ отрицательно коррелирует с КДО на 7-е сутки (R=–0,8; р=0,01) и КДО и КСО ЛЖ на 21-е сутки ИМ (R=–0,8; р=0,004). Мобилизация относительного количества CD133+ клеток в кровь в ранние сроки ИМ положительно коррелирует с уровнем ФВ ЛЖ на 21-е сутки заболевания (R=0,7; р=0,02). Таким образом, данная мобилизация CD117+ и CD133+ клеток ассоциирована с благоприятным течением и прогнозом заболевания. Установлены множественные положительные корреляционные связи между как абсолютным, так и относительным количеством CD34+38-, CD90+34- клеток и КДО, КСО ЛЖ во все сутки ИМ, отрицательные корреляции с ФВ в разные дни заболевания (табл. 1, 2). То есть, высокий выброс CD34+38-, CD90+34- клеток в кровь тесно сопряжен с ремоделированием ЛЖ в виде увеличения объемов и снижения ФВ ЛЖ.

Полученные результаты демонстрируют участие СК в развитии острого первичного крупноочагового ИМ. По-

Рис. 3. Динамика абсолютного и относительного количества CD34+38- клеток в крови в 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки острого инфаркта миокарда: * – достоверность различий изменения показателей между больными и добровольцами, p<0,05

CD90+34- клетки, абсолютное кол-во

s

CD90+34- клетки, относительное кол-во

Рис. 4. Динамика абсолютного и относительного количества CD90+34- клеток в крови в 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки острого инфаркта миокарда: * – достоверность различий изменения показателей между больными и добровольцами, p<0,05

добно нашим данным, S. Shintani и W. Wojakowski описывают возрастание количества СК в крови при остром ИМ в течение 12 ч после возникновения симптомов в срав-

Таблица 1

Коэффициенты корреляции между абсолютным, относительным содержанием CD34+38- клеток в крови и основными эхокардиографическими параметрами у больных острым инфарктом миокарда

Показатели	Абсолютное количество						Относительное количество
	1-е сутки		3-и сутки		7-е сутки		1-е сутки		3-и сутки		7-е сутки
	R	р	R	p	R	p	R	p	R	p	R	p
КДО 1-е сут	0,8	0,01	0,5	0,2	0,8	0,02	0,6	0,1	0,5	0,1	0,3	0,4
КСО 1-е сут	0,7	0,02	0,5	0,2	0,5	0,2	0,1	0,8	0,1	0,9	–0,2	0,5
ФВ 1-е сут	–0,1	0,9	0,1	0,8	0,4	0,2	0,5	0,2	0,4	0,3	0,6	0,07
КДО 3-и сут	0,5	0,08	–0,04	0,9	0,6	0,05	0,6	0,05	0,3	0,3	0,1	0,7
КСО 3-и сут	0,4	0,2	–0,1	0,7	0,4	0,2	0,6	0,05	0,3	0,4	0,2	0,6
ФВ 3-и сут	0,4	0,2	0,4	0,2	0,4	0,2	–0,4	0,2	–0,1	0,6	–0,6	0,04
КДО 7-е сут	0,3	0,3	–0,2	0,6	0,1	0,7	0,4	0,1	0,2	0,5	0,1	0,8
КСО 7-е сут	0,2	0,5	–0,3	0,3	0,2	0,6	0,3	0,2	0,1	0,6	0,1	0,7
ФВ 7-е сут	0,03	0,9	0,4	0,2	0,04	0,9	–0,2	0,5	–0,1	0,8	–0,1	0,8
КДО 21-е сут	0,6	0,02	0,2	0,6	0,4	0,2	0,3	0,3	–0,02	0,9	–0,1	0,6
КСО 21-е сут	0,4	0,1	0,07	0,8	0,3	0,3	0,2	0,4	0,2	0,5	–0,1	0,7
ФВ 21-е сут	–0,1	0,7	0,03	0,9	–0,1	0,7	–0,1	0,6	–0,4	0,1	0,004	1,0
КДО 6 мес.	0,2	0,5	0,1	0,8	0,2	0,6	0,5	0,07	–0,02	0,9	–0,2	0,6
КСО 6 мес.	0,1	0,7	0,1	0,8	–0,2	0,6	0,5	0,06	0,3	0,2	–0,2	0,5
ФВ 6 мес.	0,03	0,9	–0,1	0,8	0,3	0,4	–0,4	0,1	–0,5	0,06	0,1	0,6

Таблица 2

Коэффициенты корреляции между абсолютным, относительным содержанием CD90+34- клеток в крови и основными эхокардиографическими параметрами у больных острым инфарктом миокарда

Показатели Абсолютное количество Относительное количество 1-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 1-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 21-е сутки R р R p R p R p R p R p R р КДО 1-е сут 0,5 0,2 –0,4 0,4 0,9 0,04 –0,4 0,4 0,1 0,8 –0,5 0,2 –0,5 0,3 КСО 1-е сут 0,5 0,3 –0,2 0,6 0,8 0,01 –0,04 0,9 0,2 0,7 –0,2 1,0 0,03 1,0 ФВ 1-е сут 0,3 0,5 –0,1 0,7 0,3 0,4 –0,1 0,9 –0,2 0,7 0,1 0,8 –0,1 0,9 КДО 3-и сут 0,5 0,2 –0,2 0,6 0,9 0,01 0,2 0,5 0,5 0,09 0,3 0,4 –0,04 0,9 КСО 3-и сут 0,4 0,3 –0,5 0,2 0,9 0,01 0,3 0,4 0,6 0,04 0,3 0,4 0,02 1,0 ФВ 3-и сут 0,2 0,7 0,5 0,3 –0,1 0,8 –0,5 0,1 –0,02 1,0 –0,2 0,6 –0,2 0,6 КДО 7-е сут 0,6 0,1 0,1 0,8 0,9 0,002 –0,01 1,0 0,1 0,7 –0,03 0,9 0,1 0,8 КСО 7-е сут 0,4 0,3 –0,02 1,0 0,9 0,01 0,2 0,4 0,3 0,3 0,1 0,7 0,2 0,5 ФВ 7-е сут –0,1 0,8 0,05 0,9 –0,6 0,1 –0,4 0,1 –0,3 0,4 –0,01 1,0 –0,7 0,01 КДО21-е сут 0,5 0,2 –0,1 0,8 0,8 0,01 0,1 0,8 0,2 0,4 0,1 0,7 0,1 0,7 КСО 21-е сут 0,5 0,3 –0,1 0,9 0,8 0,02 0,1 0,7 0,3 0,2 0,2 0,6 0,2 0,6 ФВ 21-е сут –0,1 0,7 –0,04 0,9 –0,5 0,2 0,04 0,9 –0,3 0,2 –0,03 0,9 –0,1 0,7 КДО 6 мес. 0,3 0,5 –0,1 0,9 0,5 0,2 –0,1 0,7 –0,01 1,0 –0,1 0,8 –0,1 0,8 КСО 6 мес. 0,3 0,5 0,04 0,9 0,6 0,1 0,1 0,9 –0,3 0,3 0,2 0,6 –0,2 0,6 ФВ 6 мес. –0,4 0,4 0,1 0,8 –0,8 0,02 0,1 0,9 0,2 0,4 –0,01 1,0 0,2 0,6 нении со здоровыми лицами [12, 15]. Мы показали, что абсолютное и относительное количество циркулирующих в крови CD34+38-, CD133+, CD117+, CD90+34- клеток остается повышенным на протяжении всего периода госпитализации.

Установлена нелинейная динамика содержания циркулирующих в крови CD34+38-, CD133+, CD117+, CD90+34-клеток на 3-и сутки ИМ в зависимости от их исходного значения. Почему же у одних больных организм моментально реагирует на стрессовую реакцию (острый ИМ) путем выброса СК в кровь, а у других только спустя время? Вероятнее всего, причиной является состояние гемопоэтической и иммунной систем человека в момент “стресса”. Одним из важных компонентов иммунной системы являются цитокины. Количество продуцируемых цитокинов связано с размером очага повреждения, то есть большая зона инфаркта может быть более сильным стимулом для высвобождения цитокинов и, соответственно, клеточной мобилизации в кровь, и наоборот, что подтверждается результатами исследования A.M. Leone [7]. Исходно низкое содержание СК в периферическом русле, возможно, связано с тем, что в зоне большого ИМ синтез, например, SDF-1 или SCF в периинфарктных КМЦ может быть значительно выше и может индуцировать более эффективное привлечение клеток, что ведет к снижению числа клеток в периферической крови по сравнению с менее распространенным ИМ [15].

Заключение

Таким образом, по результатам нашего исследования с учетом выявленных корреляционных взаимосвязей установлено, что у больных острым первичным крупноочаговым ИМ высокий уровень циркулирующих в крови СD117+, CD133+ клеток ассоциирован с благоприятным течением и прогнозом заболевания в виде улучшения сократительной функции сердца. А высокий выброс CD34+38-, CD90+34- клеток тесно сопряжен с процессами ремоделирования ЛЖ в виде увеличения его объемов и снижения ФВ.