Цитокин-опосредованные механизмы коррекции агрессивного поведения модулированными in vitro иммунокомпетентными клетками

Масштабная межличностная агрессия и насилие являются распространенными симптомами множественных психических расстройств и представляют собой серьезную глобальную проблему для здравоохранения [1, 2, 3, 5, 7]. Использование экспериментальных моделей, которые достоверно фиксируют основные черты насильственных действий человека, в сочетании с новыми технологиями картирования, измерения и манипулирования активностью нейронов в головном мозге значительно расширяют современное понимание этиологии, нейромолекулярных механизмов агрессии, равно как и возможности потенциальных терапевтических подходов купирования чрезмерно агрессивного поведения у людей [1, 2, 7, 8]. Вместе с тем текущие терапевтические стратегии ограничены из-за отсутствия всестороннего понимания нейронных и молекулярных механизмов, лежащих в основе «порочного» перехода нор- мальной адаптивной агрессии в насилие, и триггеров окружающей среды, которые его вызывают. Экспериментальный подход, развиваемый в последние десятилетия, позволяет формировать агрессивный тип поведения у самцов мышей в результате повторного опыта побед в ежедневных внутривидовых конфронтациях [7, 8, 9]. Исследования показали, что по своим проявлениям и последствиям для организма состояние агрессивных животных очень сходно с таковым у людей, проявлявших агрессию и насилие по отношению к другим людям. Представляется, что видоспецифическими и различающимися у животных и людей могут быть только стимулы и условия, запускающие или провоцирующие проявление агрессивного поведения. При этом физиология агрессии, особенно физической, её нейробио-логические механизмы и разрушающие последствия для организма являются общими [1, 7, 8, 9, 10].

В настоящее время имеется большое число клинических и экспериментальных данных, свидетельствующих о взаимосвязанных изменениях функциональной активности основных гомеостатических систем организма при агрессии. Ведущими звеньями патогенетического механизма агрессии является нарушение продукции и взаи-морегуляции цитокинов, нейромедиаторов, нейропептидов, ростовых факторов, гормонов, эффекты которых опосредуются иммунокомпетентными клетками (ИКК). Так, нейрохимическая регуляция агрессивных форм поведения обусловлена включением дофамин-, серотонин-, ГАМК-, норадренергической и опиоидных нейропепти-дергических систем мозга [7, 11, 12, 13]. Установлено, что центральные нейромедиаторные системы, включенные в нейробиологические механизмы агрессивного поведения, также играют важную роль в психонейроиммуномодуляции, влияя на интенсивность иммунного ответа и функциональную активность ИКК. В частности со снижением активности серотонинергической системы при стресс-индуцированной агрессии и доминированием дофаминергической системы мозга, имеющей существенное значение в иммуностимуляции, связывают повышение интенсивности гуморального иммунного ответа у агрессивных мышей [7, 14].

Показано также, что формирование агрессивного поведения у самцов сопровождается перераспределением субпопуляций лимфоцитов в костном мозге, в селезенке и тимусе: увеличением количества СD4+ при снижении количества СD8+-клеток [6, 14]. Кроме того, продемонстрировано усиление цитотоксической активности NK-клеток селезенки и пролиферативного ответа спленоцитов в ответ на Т-зависимый митоген [6]. В формировании агрессивного поведения установлена патогенетическая роль продуцируемых ИКК цитокинов IL-1β, IL-4, IL-6, IL-18, TNF-α, IFN-α, IFN-γ [6, 7, 15, 17, 18, 19]. В ЦНС активи-рованая микроглия, астроциты, нейроны и эндотелиальные клетки также продуцируют ряд цитокинов и экспрессируют рецепторы к ним. Изменение цитокинового профиля и презентации интерлейкиновых рецепторов в патогенетически значимых отделах мозга рассматривается в качестве одного из механизмов иммунной дизрегуля-ции функций ЦНС при агрессии [6, 15, 16].

В лаборатории нейроиммунологии НИИФКИ впервые была установлена возможность и определены основные механизмы направленного формирования/изменения паттернов поведения экспериментальных животных трансплантацией ИКК с определенными функциональными характеристиками [19, 21, 22, 23]; представлены возможность и механизмы коррекции стресс- индуцированного поведения, включая агрессивное поведение, трансплантацией модулированных психоактивным веществом ИКК [24, 25, 26, 27, 28, 29]. Способность ИКК после адоптивного переноса модулировать поведение и когнитивные функции, в том числе и путем непосредственного контакта с клетками ЦНС, показана впоследствии и другими исследователями [30, 31]. Принимая во внимание важную роль цитокинов, продуцируемых как периферическими ИКК, так и клетками ЦНС, в патогенетических механизмах агрессии, была определена цель настоящей работы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование уровня цитокинов в ЦНС и их продукции периферическими иммунокомпетентными клетками у агрессивных реципиентов после трансплантации модулированных in vitro аминазином сингенных иммунокомпетентных клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

На базе лаборатория нейроиммунологии НИИФКИ (Новосибирск) выполнено исследование на мышах-самцах (CBA x C57BL/6)F1, четырехмесячного возраста, весом 22-25 граммов, полученных из питомника НИЛЭМ (Томск). Животных содержали в условиях лабораторного вивария в клетках по 10 особей в каждой, на стандартной диете, при естественном световом режиме. Исследования с животными проводились в соответствии с законодательством Российской Федерации, положениями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22.09.2010 г. по охране животных, используемых в научных целях, требованиями и рекомендациями Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных.

Учитывая наличие в популяции половозрелых мышей-самцов (CBA × C57BL/ 6)F1 особей с активным и пассивным типами поведения, характеризующихся различными психофизиологическими реакциями на стрессовые воздействия [19, 20, 31], для формирования однородных экспериментальных групп животных все мыши были предварительно протестированы в «открытом поле». В эксперимент были включены только особи, которые демонстрировали активный тип ориентировочно-исследовательского поведения. Агрессивный фенотип у мышей формировался в результате 20-кратного опыта побед в ежедневных межсамцовых конфронтациях с подчиненным партнером (модель хронического социального конфликта) [9]. Релевантность используемой модели обусловлена тем, что у животных моделей фармакология и нейрохимия агрессии, эмоциональное состояние и поведенческие реакции удовлетворяют формальным критериям, которые приводятся в литературе для обозначения обученной агрессии у людей [1, 2, 10].

Агрессивные самцы (CBA×C57BL/6)F1 использовались в последующих экспериментах в качестве доноров и реципиентов ИКК. ИКК агрессивных доноров были выделены в стерильных условиях из суспензии клеток селезенки, обработаны in vitro аминазином и трансплантированы внутривенно сингенным агрессивным реципиентам, как это было подробно описано ранее [20, 27, 28]. В контрольной группе агрессивных реципиентов подготовка и трансплантация ИКК была проведена в аналогичных условиях, за исключением того, что прекультивирование ИКК проводилось без аминазина.

Количественное содержание цитокинов определяли в лизатах патогенетически значимых для состояния агрессии структур головного мозга (гиппокамп, гипоталамус, стриатум, фронтальная кора) и культуральных супернатантах спленоци-тов сингенных агрессивных реципиентов.

Для определения содержания цитокинов в супернатантах спленоциты культивировали в концентрации 2х10⁶/мл в объеме 2 мл в 24-луночных планшетах для иммунологических исследований (Libro, USA) в полной культуральной среде, содержащей RPMI-1640, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone), 2 мМ L-глютамина (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»), 10 мМ HEPES-буфера (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина («Синтез») в течение 24 часов ‒ для исследования продукции IL-1β и TNF-α, 48 часов ‒ для IL-2, IL-6 и IL-10, 72 часа ‒ для оценки продукции спленоцитами IFN-γ. Для исследования стимулированной продукции цитокинов в культуральную среду добавляли липополисахарид (ЛПС) E. сoli 011: B4 (Sigma) в качестве митогена для IL-1β, TNF-α и IL-6, конканавалин А (Кон А, Pharmacia) ‒ для IL-2, IFN-γ и IL-10 в концентрациях, стимулирующих субоптимальную продукцию каждого из цитокинов, определенную в серии предварительных экспериментов. По окончании культивирования клеточную суспензию собирали, клетки осаждали центрифугированием, а культуральный супернатант использовали для исследования.

Лизаты отдельных структур мозга получали путем гомогенизирования тканей в неполной среде RPMI-1640 с добавлением 0,1% Triton X-100 (GERBU Biotechnik GmbH), с последующим центрифугированием в течение 3 минут при 10 000 оборотов/мин. Надосадочную жидкость использовали для исследования.

Для выявления трансплантированных ИКК в паренхиме селезенки и головного мозга сингенных агрессивных реципиентов была проведена прижизненная окраска прекультивированных с аминазином спленоцитов витальным красителем CFSE (Invitrogen, USA) по методике фирмы-производителя. Агрессивных реципиентов забивали путем цервикальной дислокации на 3-и сутки после трансплантации клеток с последующим выделением селезенки и головного мозга. Клеточную суспензию ткани головного мозга перед проведением цитометрического исследования разделяли на трёхступенчатом градиенте перкол-ла (Sigma) по описанной методике для обогащения образцов лимфоцитарной фракцией [33]. Цитометрический анализ проводили с помощью проточного цитофлюориметра BD FACSVerse и программного обеспечения BD FACSuite (BD Biosciences, USA).

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ SPSS 11.0. При анализе количественных данных проверку на нормальность распределения фактических данных проводили с помощью W-критерия Шапиро-Уилка. Для каждой из непрерывных величин определяли среднее (М) и стандартное (SD) отклонение. При проведении сравнений независимых выборок (при числе групп, равном 2) в случае нормального распределения и равных дисперсий в группах применяли t-критерий Стьюдента для независимых наблюдений; при отклонении распределения от нормального применяли U-критерий Манна-Уитни. Для множественного сравнения показателей использовали H-критерий Краскела-Уоллиса. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в исследовании принимался p≤0,05. Объем выполненных исследований позволял оценить результаты со статистической значимостью 95-99% при использовании соответствующих статистических методов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Цитокины, являясь как иммунорегуляторами, так и нейромодуляторами, обладают выраженными психо- и нейротропными свойствами и вовлекаются в механизмы формирования агрессивного поведения, индуцированного социальным стрессом. Известно, что формирование агрессивного поведения ассоциировано как с модуляцией продукции цитокинов периферическими ИКК, так и с изменением цитокинового профиля в ряде структур головного мозга, где при формировании агрессивного фенотипа установлено повышение уровней провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-2 и IL-6 [7, 14, 15, 16, 17, 18, 19], что подтверждено и в собственных исследованиях. Ранее нами также было обнаружено, что прекультивирование с аминазином спленоцитов агрессивных мышей (CBA x C57BL/6)F1 вызывает модуляцию функциональной активности указанных клеток. В частности это проявляется в снижении продукции цитокинов IL-2, IL-6 и ИНФ-γ; а внутривенное введение указанных ИКК приводит у сингенных агрессивных реципиентов к снижению агрессивной мотивации, уровня агрессивности, тревожности и локомоторной активности [20, 27, 28, 29].

В настоящем исследовании выявлено, что редактирование характерных для состояния агрессии паттернов поведения у реципиентов модулированными аминазином спленоцитами регистрировалось на фоне изменения количественного содержания ряда цитокинов в патогенетически значимых для агрессии структурах головного мозга (рис. 1).

Р и с у н о к 1. Содержание цитокинов (пг/мл) в лизатах патогенетически значимых структур головного мозга агрессивных реципиентов (CBA x C57Bl/6)F1 после трансплантации сингенных спленоцитов, модулированных in vitro аминазином

П р и м е ч а н и я: ■ – образцы супернатантов лизатов соответствующей структуры головного мозга агрессивных реципиентов после трансплантации спленоцитов, прекультивированных без аминазина (контроль); ■ ‒ образцы супернатантов лизатов соответствующей структуры головного мозга агрессивных реципиентов после трансплантации спленоцитов, прекультивированных с аминазином (опыт).

Результаты представлены в виде M±SD; n=12 в каждой группе; * ‒ p<0,05 между соответствующими показателями клеток в контрольной и опытной группах реципиентов.

Так, в гиппокампе наблюдалось снижение IL-1β, IFN-γ, IL-2, IL-6, в гипоталамусе ‒ снижение IFN-γ и повышение IL-4, во фронтальной коре ‒ снижение IL-1β. Выявленный вектор изменения уровней указанных регуляторных цитокинов в сторону снижения ряда провоспалительных и повышения противовоспалительного IL-4 свидетельствует о снижении нейровоспаления. Подтверждением тому служат также полученные нами данные о снижении экспрессии маркера воспаления белка Iba-1 в указанных структурах мозга у агрессивных реципиентов после трансплантации модулированных аминазином сплено-цитов (данные не приводятся).

В связи с тем, что цитокины из периферической крови могут проникать в мозг и индуцировать в нем выработку собственных цитокинов, важным является оценка их продукции иммунокомпетентными клетками у агрессивных реципиентов.

В результате проведенных исследований установлено, что трансплантация спленоцитов с модулированной in vitro аминазином функциональной активностью сингенным реципиентам с агрессивным фенотипом вызывала у последних изменение стимулированной продукции ряда цитокинов: снижение ИНФ-γ, IL-2, IL-6 и IL-10 и повышение TNF-α (рис. 2).

Р и с у н о к 2. Продукция цитокинов (пг/мл) клетками селезенки агрессивных реципиентов (CBA x C57Bl/6)F1 после трансплантации сингенных спленоцитов, модулированных in vitro аминазином

П р и м е ч а н и я: А ‒ спонтанная продукция цитокинов, Б – митоген-стимулированная продукция цитокинов, ■ – образцы супернатантов клеток селезенки агрессивных реципиентов после трансплантации сплено-цитов, прекультивированных без аминазина (контроль), ■ – образцы супернатантов клеток селезенки агрессивных реципиентов после трансплантации спленоцитов, прекультивированных с аминазином (опыт).

Результаты представлены в виде M±SD; n=10 в каждой группе; * ‒ p<0,05; ** ‒ p<0,01 между соответствующими показателями в контрольной и опытной группах клеток.

Можно полагать, что в качестве триггерных факторов, приводящих к изменениям функциональной активности ЦНС у агрессивных реципиентов после внутривенного введения модулированных аминазином ИКК, выступают продуцируемые этими клетками цитокины, равно как и цитокины, продуцируемые собственными ИКК реципиентов. При этом изменение функциональной активности последних может быть обусловлено

А хоумингом трансплантированных клеток и их межклеточным контактом с клетками селезенки реципиентов. Подтверждением тому служат полученные нами данные о визуализация прекуль-тивированных с аминазином спленоцитов агрессивных доноров в паренхиме селезенки сингенных агрессивных реципиентов (рис. 3).

Р и с у н о к 3. Прекультивированные с аминазином, меченные CFSE спленоциты агрессивных доноров (CBA x C57BL/6)F1 в паренхиме селезенки сингенных агрессивных реципиентов

П р и м е ч а н и е. Цитограмма А не гейтирована (ungated): выделение популяции спленоцитов (выделено красным) по параметрам бокового (SS) и прямого (FS) светорассеяния. Гистограмма Б (гейтированная): показатель CFSE, гейтированный по области спленоцитов цитограммы А, для выявления относительного содержания меченных CFSE спленоцитов от общего числа спленоцитов.

Б

По всей видимости, головной мозг реагирует на изменение цитокинового профиля на периферии и отвечает на этот стимул модуляцией как собственного локального синтеза цитокинов, так и активности центральных нейромедиаторных систем, включённых в нейробиологические механизмы, контролирующие различные типы агрессивного поведения [7, 11, 14, 16]. Цитокины, таким образом, вовлекаются в механизмы, лежащие в основе развития агрессивных реакций, следствием чего и являются регистрируемые нами изменения характерных для состояния агрессии паттернов поведения. Выявленные противоположные изменения уровней цитокинов в патогенетически значимых структурах головного мозга и в культуральных супернатантах спленоцитов, наблюдаемые при формировании агрессивного поведения [15, 16, 17, 18, 19] и его редактировании модулированными аминазином ИКК, под- тверждают цитокин-опосредованный механизм коррекции агрессивного поведения реципиентов.

Имеются также данные о том, что не только цитокины, но и иммунокомпетентные клетки могут проникать в головной мозг и изменять функциональное состояние ЦНС, включая поведенческие реакции, путем непосредственного контакта с клетками головного мозга [30, 31]. Обусловленная нейровоспалением повышенная проницаемость гематоэнцефалического барьера при индуцированной хроническим социальным стрессом агрессии предполагает и этот механизм влияния трансплантированных ИКК на функции мозга, включая синтез цитокинов с их последующим регулирующим влиянием на поведенческие реакции. Подтверждением чему служит визуализация лимфоцитарной фракции прекультивированных с аминазином спленоцитов в паренхиме головного мозга агрессивных реципиентов (рис. 4).

Р и с у н о к 4. Цитограмма лимфоцитарной фракции клеток головного мозга агрессивных реципиентов (CBA x C57BL/6)F1 после внутривенного введения меченных CFSE сингенных спленоцитов, прекультивированных с аминазином

П р и м е ч а н и я: А ‒ диаграмма фронтального-бокового рассеяния, [cell] – область лимфоцитарного облака, Б ‒ диаграмма бокового рассеяния против CFSE, гейтирована по области [cell] цитограммы А, предназначена для выявления относительного содержания меченных CFSE лимфоцитов от общего числа лимфоцитов.

Обращает на себя внимание тот факт, что на момент тестирования (3-и сутки после системного введения клеток) регистрируются, как минимум, две выраженных генерации лимфоцитов (рис. 4, цитограмма Б), свидетельствующие об их пролиферативной активности, что убедительно свидетельствует о том, что введенные ИКК в мозге функционально активны и показанные выше изменения в уровнях цитокинов в головном мозге в том числе могут быть и результатом непосредственного влияния трансплантированных иммунокомпетентных клеток, модулированных ex vivo аминазином, на клетки ЦНС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные результаты собственных исследований позволяют рассматривать существование относительно независимых цито-кин-опосредованных механизмов редактирования агрессивного поведения системно введенными ИКК с модулированной in vitro аминазином функциональной активностью.